CRISPR é uma técnica de edição genômica de terceira geração: CRISPR revolucionou o mundo.

A técnica CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) é uma técnica de edição genômica de terceira geração que revolucionou o mundo com seus resultados de alto rendimento. Ela tem sido usada para tratar diversas doenças e infecções biológicas. Várias bactérias e outros procariontes (como arqueas) também possuem sistemas CRISPR/Cas9 para se defenderem contra bacteriófagos. Há relatos de que estratégias baseadas em CRISPR/Cas9 podem inibir o crescimento e a progressão do câncer de mama triplo negativo (CMTN) ao atingir genes de resistência potencialmente alterados, a transcrição e a regulação epigenética. Essas intervenções terapêuticas podem ajudar a solucionar problemas desafiadores, como a resistência a medicamentos observada mesmo no CMTN. Atualmente, vários métodos são usados ​​para administrar o CRISPR/Cas9 às células-alvo, como métodos físicos (microinjeção, eletroporação e hidrodinâmicos), virais (vírus adeno-associados e lentivírus) e não virais (lipossomas e nanopartículas lipídicas). Embora diversos modelos tenham sido desenvolvidos para estudar as causas moleculares do câncer de mama triplo negativo (CMTN), a falta de métodos sensíveis e direcionados para a administração de ferramentas de edição genômica in vivo limita sua aplicação clínica. Em resumo, esta revisão examina de forma abrangente o progresso, os desafios, as limitações e as perspectivas do tratamento com CRISPR/Cas9 para CMTN com base nas evidências existentes. Também destacamos como a combinação de inteligência artificial e aprendizado de máquina pode aprimorar as estratégias de CRISPR/Cas9 no tratamento do CMTN.
O câncer é caracterizado por divisão celular descontrolada, ruptura dos pontos de controle do ciclo celular e mutações em genes supressores de tumor (GSTs) (Matthews et al., 2022). Dentre os diferentes tipos de câncer, o câncer de mama é o mais comum em mulheres e apresenta alta taxa de mortalidade em todo o mundo (Waks e Winer, 2019). O câncer de mama é uma doença heterogênea com diversas características, como aspectos histológicos e biológicos, apresentação e comportamento clínico e resposta ao tratamento (Weigelt et al., 2010). A classificação do câncer de mama fornece informações precisas para o diagnóstico e prognóstico do tumor. O uso de biomarcadores comuns e características clinicopatológicas tem sido o principal critério para a classificação do câncer de mama (Tsang e Tse, 2019). O prognóstico e a resposta ao tratamento do câncer de mama são influenciados por inúmeros fatores, incluindo a presença de receptor de estrogênio (RE), receptor de progesterona (RP), receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2/neu), grau histológico, tipo e grau do tumor. tamanho e metástase em linfonodos (Al-Tubaiti, 2020). Cinco subtipos moleculares intrínsecos de câncer de mama foram identificados, incluindo luminal A, luminal B, HER2-enriquecido, basal-like e claudina-baixo (Prat et al., 2015). O câncer de mama triplo-negativo (CMTN) é um subtipo molecular de câncer que não expressa todos os receptores de estrogênio (RE), progesterona (RP) e HER2 (Yin et al., 2020). Essas características patológicas estão associadas ao CMTN, confirmando sua rápida progressão e natureza mais agressiva do que qualquer outro tipo de câncer de mama (Feng et al., 2018). Além disso, Peru et al. (2000) utilizaram a tecnologia de microarrays para reclassificar o câncer de mama e identificar cinco subtipos intrínsecos (Cadenas, 2012). O câncer de mama basal-like é um subtipo de câncer de mama que apresenta fenótipo triplo-negativo e está associado à rápida progressão. É importante notar que todos os cânceres de mama do tipo basal são frequentemente diagnosticados erroneamente como câncer de mama triplo-negativo (CMTN), mas apenas 77% deles são CMTN; em contraste, 71–91% dos CMTN são do tipo basal, indicando que esses dois tipos de câncer de mama se sobrepõem e representam classificações diferentes (Wang D.-Y. et al., 2019). Isso cria a necessidade de caracterizar a heterogeneidade do CMTN para elucidar o prognóstico e identificar possíveis respostas aos tratamentos atuais e futuros. Além disso, o CMTN representa 15–20% de todos os casos de câncer de mama e é mais comum em mulheres com menos de 50 anos de idade. Mutações nos genes BRCA1 ou BRCA2 foram relatadas em aproximadamente 20% dos casos de CMTN (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Estudos também demonstraram que o câncer de mama triplo-negativo (CMTN) possui um microambiente imunológico distinto, que inclui altos níveis de fatores de crescimento endotelial vascular, macrófagos associados ao tumor (TAMs), linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) e outras moléculas envolvidas no crescimento e migração tumoral. Portanto, compreender o microambiente do CMTN é fundamental para o seu prognóstico e tratamento (Fan e He, 2022).
Para avaliar o prognóstico do câncer de mama triplo negativo (CMTN) e garantir um tratamento eficaz, é fundamental um diagnóstico preciso, baseado principalmente em imuno-histoquímica (IHQ) para detectar receptores de estrogênio (RE), progesterona (RP) e HER2, e em mamografia para detectar neoplasias mamárias. No entanto, a mamografia não consegue representar adequadamente características intratumorais, como necrose e fibrose (Deepak Singh et al., 2021). Como o prognóstico e o diagnóstico inadequados impedem os médicos de prescreverem os medicamentos corretos (Chaudhary, 2020), diversas estratégias são utilizadas para melhorar o atendimento a pacientes com CMTN. Atualmente, dois medicamentos, doxorrubicina e ciclofosfamida, são utilizados em pacientes com CMTN e têm apresentado bons resultados. Além disso, outros medicamentos à base de platina, como carboplatina e cisplatina, também são utilizados (Sikov et al., 2015). Além disso, inibidores de PARP, como olaparibe, velaparibe e PF-01367338, têm sido utilizados como potenciais fármacos quimioterápicos para o tratamento do câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Ishino et al., 2018). Como as vias de sinalização Wnt/β-catenina, NOTCH e Hedgehog estão envolvidas na ocorrência e progressão do CMTN, o direcionamento de fármacos para essas vias pode ser uma estratégia importante (Aysola et al., 2013). Embora a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia continuem sendo os principais tratamentos para o CMTN atualmente, avanços significativos têm sido feitos no desenvolvimento de novas terapias, incluindo terapia-alvo, imunoterapia, diversas ferramentas de edição genética relacionadas ao CRISPR, como Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, edição primária e terapia gênica direcionada por CRISPR/Cas9. Neste artigo, focaremos em diversas ferramentas de edição genética relacionadas ao CRISPR utilizadas no tratamento do CMTN. Dentre elas, o CRISPR/Cas9 tem recebido grande atenção.
A Cas9n, também conhecida como Cas9 nickase, é uma variante geneticamente modificada da proteína Cas9, derivada do sistema de edição genômica CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Em sua forma original, a proteína Cas9 contém dois domínios de nuclease: RuvC e HNH, cuja principal função é a clivagem de ambas as fitas de DNA. No entanto, na Cas9n, um dos domínios de nuclease, o HNH, sofre mutação genética e torna-se inativo. Portanto, o domínio HNH da Cas9n permanece não funcional. Apenas o domínio RuvC permanece ativo, permitindo que a Cas9n corte ou crie quebras em fitas simples de DNA (Trevino e Zhang, 2014). Comparada à Cas9, a Cas9n pode reduzir efetivamente os efeitos fora do alvo e aprimorar com precisão os mecanismos de reparo celular. A Cas9n pode ser usada para resolver diversos problemas, como a criação de quebras em locais específicos no DNA de fita dupla. Para esse fim, duas moléculas de Cas9n foram combinadas e utilizadas em conjunto (Yee, 2016). A quinase de linhagem mista 3 (MLK3) é uma proteína quinase ativada por mitogênio que atua como um regulador chave durante a metástase do câncer de mama triplo negativo (CMTN) (Cronan et al., 2012).
A MLK3 pode ativar múltiplas vias de sinalização que levam à metástase do câncer de mama triplo negativo (CMTN). Por exemplo, a via da quinase N-terminal c-Jun (JNK) regula a motilidade celular e a degradação da matriz extracelular, e a MLK3 ativa a via JNK, aumentando assim a motilidade celular e conferindo propriedades invasivas (Rattanasinchai e Gallo, 2016). A MLK3 também regula a transição epitélio-mesenquimal (TEM). Para isso, ela ativa fatores de transcrição a jusante, como Snail, Slug e Twist. Esses fatores inibem a expressão de marcadores epiteliais e promovem a expressão de marcadores mesenquimais, levando à aquisição de um fenótipo metastático (Casalino et al., 2023). Observou-se que a MLK3 desempenha um papel na remodelação da matriz extracelular e na ativação de proteases, como as metaloproteinases da matriz (MMPs), que degradam a matriz extracelular. Isso facilita a invasão e a disseminação das células tumorais para locais distantes (Katari et al., 2019). Assim, estudos anteriores demonstraram que o MLK3 desempenha um papel crucial no câncer de mama triplo negativo (CMTN). Rattanasinchai e Gallo utilizaram modelos de CMTN para estudar o papel do MLK3 e descobriram que ele promove o desenvolvimento do câncer por meio de vias de sinalização específicas. Eles utilizaram a tecnologia CRISPR/Cas9n para editar o MLK3 e observaram uma redução significativa na metástase do CMTN (Rattanasinchai e Gallo, 2016).
A dCas9, frequentemente chamada de Cas9 inativa, é uma forma derivada e modificada da proteína Cas9. Ao contrário da Cas9 ativa, a dCas9 não possui atividade de endonuclease, o que a torna incapaz de induzir quebras de fita dupla de DNA. Portanto, a dCas9 pode ser usada para atingir com precisão regiões específicas do genoma sem quaisquer alterações ou modificações na sequência de DNA (Wang et al., 2016). Na dCas9, duas proteínas de endonuclease, RuvC e HNH, são inativadas pela supressão de resíduos de aminoácidos importantes (Richter et al., 2016). Apesar da sua falta de atividade de clivagem de DNA, a dCas9 desempenha uma série de funções importantes na pesquisa genética e na biotecnologia. Por exemplo, permite a visualização de regiões específicas do genoma, facilita a regulação transcricional e promove modificações epigenéticas (Brocken et al., 2018).
O fator de transcrição ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) desempenha um papel específico e crítico na mediação da transição epitélio-mesenquimal (TEM), um processo celular que ocorre durante o desenvolvimento embrionário, reparo tecidual e progressão do câncer. Envolve a transformação de células epiteliais em células mesenquimais, resultando em alterações na morfologia celular, motilidade, invasividade, etc. (Wu et al., 2020). O ZEB1 inibe múltiplos marcadores epiteliais, como a E-caderina e a ocludina, que são responsáveis ​​pela manutenção da adesão célula-célula e da polaridade das células epiteliais no câncer de mama triplo negativo (CMTN) (Moreno-Bueno et al., 2008). Além disso, o ZEB1 ativa certos marcadores, como N-caderina, vimentina e fibronectina (Konradi et al., 2014), e também regula genes envolvidos na remodelação do citoesqueleto, como as GTPases Rho e as metaloproteinases da matriz (MMPs) (Huang et al., 2014; 2022). Ademais, ele também afeta diversas vias de sinalização, como o fator de crescimento transformador β (TGF-β), a sinalização Wnt, etc., promovendo assim a invasão tumoral e a metástase no câncer de mama triplo negativo (CMTN) (Chen et al., 2016). Numerosos estudos e evidências científicas indicam que o ZEB1 possui grande potencial como um agente valioso para a detecção e intervenção terapêutica do CMTN. Em um estudo recente, Waryah et al. utilizaram um modelo de CMTN e obtiveram a supressão completa do ZEB1 por meio do dCas9. Assim, eles observaram uma especificidade muito alta e uma inibição quase completa do ZEB1 em condições in vivo (Waryah et al., 2023).
O CRISPR/Cas12 é uma ferramenta de edição genética chamada CRISPR/Cpf1. Deriva do sistema CRISPR/Cas, onde o termo Cas12 se refere à proteína 12 associada ao CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), que é completamente similar à Cas9. A única diferença é que o CRISPR/Cas12 contém a proteína Cas12. Comparado à Cas9, o Cas12 possui algumas funções únicas, como a geração de extremidades coesivas durante o processo de edição genética, enquanto a Cas9 gera extremidades rombas (Wang et al., 2021). Essa propriedade do Cas12 contribui para sua tecnologia específica de manipulação de DNA. Como uma proteína capaz de reconhecer e cortar o DNA alvo com precisão, o CRISPR/Cas12 possui uma versatilidade extraordinária, tornando-se uma ferramenta eficaz para diversas aplicações, incluindo a edição genética (Pickar-Oliver e Gersbach, 2019).
Semelhante a outras variantes do CRISPR, o CRISPR/Cas12 também é capaz de inativar ou ativar genes no câncer de mama triplo negativo (CMTN), visando genes que desempenham um papel importante em sua patogênese ou resposta ao tratamento (Yang e Zhang, 2023). Para realizar esse processo, um RNA guia (gRNA) foi desenvolvido para direcionar o Cas12 ao gene alvo. Uma vez que o Cas12 se liga ao seu alvo, ele introduz quebras de fita dupla no DNA e ativa mecanismos de reparo do DNA. Durante o processo de reparo, nucleotídeos incorretos podem ser incorporados, levando a mutações genéticas e perda de função (Zhang et al., 2021a). Além disso, uma versão aprimorada da enzima Cas12 (chamada dCas12) também foi usada para ativar genes. Ao combiná-la com um ativador de transcrição, é possível induzir certos genes, ativando-os. Essa tecnologia tem grande potencial para promover a ativação de genes supressores de tumor (Sultan et al., 2022).
A edição primária é uma tecnologia de edição genômica recentemente desenvolvida e extremamente superior. Ela é capaz de modificar o DNA de um organismo com muita precisão (Chen e Liu, 2023). A edição primária é alcançada por meio da integração de dois componentes principais: uma enzima CRISPR/Cas9 modificada e uma transcriptase reversa. O papel da enzima CRISPR/Cas9 é direcionar seletivamente locais precisos no genoma, enquanto a transcriptase reversa auxilia na modificação completa do DNA no local alvo (Hassan et al., 2021). No mecanismo de edição primária, a primeira etapa envolve a criação de um RNA guia de edição primária (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Ele contém a sequência alvo e o molde de RNA correspondente ao local de edição desejado no DNA alvo. O pegRNA é então introduzido nas células alvo juntamente com uma nuclease de edição primária (PE2). A PE2 é uma proteína de fusão composta por uma enzima Cas9, uma transcriptase reversa e um adaptador de edição primária (Martín-Alonso et al., 2021). Dentro da célula, os complexos pegRNA e PE2 procuram o DNA específico que desejam modificar. A enzima Cas9 corta o DNA e cria um molde composto por fitas simples (Choi et al., 2022). A transcriptase reversa utiliza esse molde para preparar o DNA para edição. Juntamente com a cópia do DNA, as instruções para editar o molde de RNA também são incluídas. Finalmente, a fita de DNA recém-criada é usada como molde para reparar a quebra no DNA, resultando em uma sequência de DNA alterada contendo a modificação desejada (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Os mecanismos de edição por primers podem levar a mutações generalizadas em genes. Podem atingir mutações pontuais, inserções, deleções e até mesmo substituições de genes (Anzalone et al., 2019; Chen e Liu, 2023). A edição por primers oferece diversas vantagens em relação às tecnologias anteriores de edição genômica. Essas vantagens incluem maior precisão, redução de efeitos fora do alvo e a capacidade de editar o DNA sem depender de quebras de fita dupla (Anzalone et al., 2020).
A tecnologia CRISPR/Cas9 foi originalmente desenvolvida para proteger bactérias da transferência de plasmídeos e da infecção por fagos, sendo posteriormente reaproveitada como uma ferramenta eficaz de direcionamento de DNA baseada em RNA para edição genômica (Jiang e Doudna, 2017). Além disso, o sistema CRISPR/Cas9 está presente em 50% e 87% dos genomas bacterianos e arqueanos, respectivamente (Ishino et al., 2018). O CRISPR/Cas9 é uma ferramenta potencial para deleção, inserção e correção de qualquer sequência genética anormal, utilizando métodos in vivo e in vitro (Sabit et al., 2021). Ademais, o CRISPR/Cas9 demonstrou fazer parte do sistema imunológico adaptativo devido à sua especificidade para genes-alvo de interesse (Chen e Zhang, 2018).
O sistema CRISPR/Cas9 consiste na proteína Cas9 e em um único RNA guia (sgRNA). A Cas9 é uma endonuclease composta por múltiplos componentes proteicos. Além disso, a Cas9 possui propriedades estruturais e conformacionais únicas (Pacesa et al., 2022), pois consiste em dois lóbulos: reconhecimento (REC) e nuclease (NUC). O lóbulo REC é subdividido em três regiões: REC1, REC2 e hélices de ponte (Cromwell et al., 2018). O NUC consiste em três lóbulos, a saber, RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH e o domínio de interação com o motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) (Figura 1) (Song et al., 2016). O sgRNA consiste em dois componentes, incluindo o RNA CRISPR (crRNA) e o pequeno RNA transcodificador (RNA traçador) (Figura 1). O sgRNA conecta a proteína Cas9 às conexinas para formar um complexo ativo, também conhecido como complexo efetor (Richter et al., 2012). O crRNA é um par de bases de 18 a 20 nucleotídeos que desempenha um papel crucial no reconhecimento de sequências de DNA alvo. Além disso, o crRNA se pareia com o DNA alvo, e o tracrRNA atua como um andaime para a nuclease Cas9 se ligar ao DNA alvo (Manghwar et al., 2019). Por outro lado, a sequência PAM possui 3 nucleotídeos, que confirmam, especificam e medeiam a ligação do complexo efetor ao DNA. As subunidades RuvC e HNH do complexo proteico Cas9 possuem atividade catalítica (Richter et al., 2012; Asmamaw e Zawdie, 2021). O domínio da nuclease HNH da subunidade Cas9 cliva a fita de DNA associada ao crRNA. O domínio da nuclease RuvC cliva outras cadeias de DNA e gera quebras de cadeia dupla (DSBs), após o que dois mecanismos diferentes de reparo de quebras de DNA são ativados (Jiang e Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Visão geral do CRISPR/Cas9 (A). Componentes do sistema CRISPR/Cas9: (i) A endonuclease Cas9 é responsável por cortar a sequência de DNA alvo, (ii) um RNA guia único (sgRNA) resultante da fusão de quimeras de crRNA e tra-crRNA. (iii) O Cas9 inclui vários componentes, como Rec I, Rec II, lóbulo NUC (HNH e Ruv C são subcomponentes) e domínio de interação PAM (C), com funções correspondentes. O complexo proteico CRISPR/Cas9 cliva sequências de DNA em formas não complementares e complementares (D). O CRISPR/Cas9 edita o genoma em três etapas: reconhecimento, corte e reparo. O sgRNA projetado guia o Cas9 e reconhece a sequência desejada através do componente complementar crRNA. O Cas9 reconhece a sequência PAM em 5′-NGG-3′ e funde o DNA, formando um híbrido DNA-RNA e ativando a clivagem. O domínio HNH da Cas9 cliva a fita complementar, e o domínio RuvC cliva a fita não complementar. O CRISPR/Cas9 repara o DNA de fita dupla quebrando-o de duas maneiras: junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e reparo direcionado por homologia (HDR). A NHEJ repara o DNA de fita dupla na ausência de DNA homólogo exógeno por meio de um processo enzimático, um mecanismo propenso a erros que pode inserir ou remover sequências aleatórias de DNA. O HDR é muito específico e requer moldes de DNA homólogos.
As vias de reparo mediadas por CRISPR/Cas9 incluem a junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e os mecanismos de reparo direcionado por homologia (HDR). A NHEJ é uma via propensa a erros porque envolve inserção ou deleção e não requer nenhum padrão durante o mecanismo de reparo. Ela utiliza nucleotídeos aleatórios para gerar proteínas padrão (Abbasi et al., 2021). Esse sistema de reparo consiste em quatro complexos, como o complexo KU, o complexo proteico de complementação cruzada tipo 4 (XRCC-4), a enzima de processamento de extremidades de DNA e a proteína quinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). A proteína do complexo KU possui duas subunidades, Ku 70 e Ku ​​80, e desempenha um papel importante no mecanismo de NHEJ, uma vez que o mecanismo de reparo é iniciado pela ligação de duas subunidades (Ku 70 e Ku ​​80) às extremidades rombas ou quase rombas do DNA alvo (Abbasi et al., 2021), servindo como um arcabouço para recrutar outros fatores relacionados ao NHEJ para o local da lesão (Yang et al., 2020). XRCC-4 e a DNA ligase são compostas por 334 e 911 aminoácidos, respectivamente, e o complexo XRCC4-DNA ligase IV estimula a ligação das extremidades do DNA (Chatterjee et al., 2015). A enzima de processamento de extremidades de DNA, também conhecida como polinucleotídeo quinase 3′-fosfato, é uma enzima de processamento de extremidades de DNA. Ela pode remover o grupo 3′P do DNA e fosforilar o grupo 5′OH durante o reparo de quebras de fita dupla (DSB). Também envolve o reparo de quebras de fita simples (SSBs) usando a via de reparo de SSB (Chatterjee et al., 2015). A proteína quinase DNA-PKcs é uma proteína quinase dependente de DNA que consiste em uma subunidade catalítica da família PIKKs (quinases relacionadas à fosfatidilinositol 3-quinase) e da família ATM (ataxia telangiectasia mutada), bem como ATM e ATRs relacionadas a Rad3. quebras de fita dupla (DSBs) e quebras de fita simples (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
A HDR é um mecanismo de reparo mais preciso e adequado, pois a informação é copiada utilizando a forma intacta do duplex de DNA homólogo, embora exija a presença de cromátides irmãs. Isso ocorre durante a fase S/G2 do ciclo celular de mamíferos. A HDR ocorre principalmente em leveduras, mas a NHEJ é crucial em mamíferos (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). O mecanismo de reparo completo é mostrado na Figura 1.
Como o câncer de mama triplo negativo (CMTN) é causado por anormalidades genéticas e epigenéticas, a correção de anormalidades genômicas/epigenômicas malignas usando CRISPR/Cas9 pode ser uma abordagem terapêutica viável (Chen et al., 2019). Além disso, alguns fatores de transcrição envolvidos na regulação transcricional específica de cada célula podem apresentar características únicas em células cancerígenas, sugerindo que a regulação transcricional pode ser uma excelente abordagem para o tratamento do câncer (Drost et al., 2017). Explorar essas características moleculares dos tumores, como defeitos genéticos, epigenéticos e transcricionais, para o desenvolvimento de fármacos pode melhorar os resultados clínicos e reduzir os custos de triagem. O CRISPR é uma ferramenta potencial de edição genética que pode não apenas detectar e identificar alvos genômicos causadores de câncer, mas também ser usada para editar, suprimir e modificar epigeneticamente oncogenes em células humanas (Tabela 1) (Ahmed et al., 2021). Diversas triagens com CRISPR foram realizadas para buscar genes associados a supressores tumorais, oncogenes e resistência a fármacos. A utilização da técnica CRISPR/Cas9 para editar diversos oncogenes do câncer de mama triplo negativo é mostrada na Figura 2.
Figura 2. Edição genética de vários oncogenes do câncer de mama triplo-negativo (CMTN) usando CRISPR/Cas9, resultando em redução do crescimento tumoral e da metástase. Esses oncogenes incluem CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 e CXCR7, Crypto1, ROR1 e ST8SIA, que estão envolvidos na ocorrência e metástase do CMTN.
A migração, invasão e transição epitélio-mesenquimal (TEM) de células cancerígenas estão associadas ao ITGA9. Estudos anteriores demonstraram que o ITGA9 é um componente chave da via Notch e desempenha um papel importante na metástase do rabdomiossarcoma (Molist et al., 2020). Além disso, o ITGA9 mostrou-se intimamente associado ao prognóstico de pacientes em diversos tipos de tumores, incluindo o câncer de mama (Wang Z. et al., 2019). Ademais, análises bioinformáticas do ITGA9 demonstraram que sua expressão no câncer de mama triplo-negativo (CMTN) foi significativamente maior do que em outros subtipos de câncer de mama. Níveis elevados de ITGA9 estão associados à metástase tumoral e à recidiva em pacientes com CMTN. A inativação do ITGA9 por meio da tecnologia CRISPR/Cas9 resultou em propriedades semelhantes às de células-tronco cancerígenas (CTCs), angiogênese tumoral, crescimento tumoral e redução da metástase, promovendo a degradação da β-catenina no CMTN (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 é um membro da família TGF-β e é crucial para a embriogênese inicial, a manutenção de células-tronco e a metástase do câncer (Ishii et al., 2021). Também conhecido como Tdgf-1, é uma proteína de sinalização oncogênica ancorada por GPI, envolvida na regulação da formação da linha primitiva, mesoderma e endoderma, bem como no estabelecimento da assimetria esquerda/direita no desenvolvimento de órgãos durante a embriogênese (Zhang et al., 2021b). Além disso, Crypto-1 demonstrou estar envolvido na transição epitélio-mesenquimal (TEM) como um marcador de células-tronco (Zhang et al., 2021b). A TEM é fundamental não apenas para diversos processos, como o desenvolvimento embrionário, a fibrose e a cicatrização de feridas, mas também para a invasão e metástase do câncer. Além disso, foi demonstrado que o Crypto-1 interage com quatro receptores Notch e aumenta sua maturação pós-translacional (Brandstadter e Maillard, 2019). Sabe-se que a via de sinalização Notch está envolvida na manutenção de células de câncer de mama humano. Estudos mostraram que o nocaute do Crypto-1 mediado por CRISPR/Cas9 suprime o crescimento e a metástase do câncer. Portanto, o Crypto-1 pode se tornar um importante alvo terapêutico para o câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Castro et al., 2015).
A proteína XCL12 e seu receptor de quimiocina CXC (CXCR4 e CXCR7) desempenham diversos papéis na proliferação, crescimento, migração e invasão de células cancerígenas (Wu et al., 2015). Esses quimiorreceptores têm sido associados ao desenvolvimento do câncer de mama triplo-negativo (CMTN) por meio de múltiplas vias de sinalização em modelos in vivo e in vitro (Wu et al., 2015). Além disso, a ativação de CXCR4 e CXCR7 está associada a maior suscetibilidade à metástase e pior prognóstico no CMTN (Karn et al., 2022). Portanto, a inativação de CXCR4 e CXCR7 pode representar um alvo terapêutico eficaz para o tratamento do câncer de mama, incluindo o CMTN. Estudo de Yang et al. Yang et al (2019) usaram CRISPR/Cas9 para inativar simultaneamente os genes CXCR4 e CXCR7 e descobriram que a proliferação, o crescimento, a migração e a invasão do câncer de mama triplo negativo foram significativamente inibidos (Yang et al., 2019).
Níveis elevados de miR-3662, um oncogene associado ao câncer de mama triplo negativo (CMTN), foram observados em tecidos mamários cancerosos (Yi et al., 2022). A redução da expressão de miR-3662 demonstrou inibir o crescimento tumoral e a metástase do câncer de mama tanto in vivo quanto in vitro (Agarwal e Gupta, 2021). HBP-1 é um potente inibidor da sinalização Wnt/β-catenina e provavelmente é responsável pelo crescimento de células de CMTN mediado por miR-3662. Recentemente, Yi et al. descobriram que o eixo miR-3662-HBP1 regula a via de sinalização Wnt/β-catenina em células de CMTN (Yi et al., 2022). Devido à sua expressão específica em tumores, o miR-3662 pode ser um alvo terapêutico potencial para o CMTN. Assim, a redução da expressão de miR-3662 mediada por CRISPR/Cas9 pode ser uma excelente abordagem para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento do CMTN.
A UBR5 é uma nucleofosfoproteína de 300 kDa identificada como um regulador chave da tumorigênese, metástase e resposta imune em diversos tipos de câncer (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Relata-se que a UBR5 apresenta alta expressão em amostras de câncer de mama triplo-negativo (CMTN) e estimula a função do receptor de estrogênio alfa (ERα) induzindo a proliferação por meio de sua atividade de ubiquitina ligase (Bolt et al., 2015). Estudos de sequenciamento de exoma completo de amostras primárias de CMTN também demonstraram aumento na expressão de UBR5, sugerindo seu papel no desenvolvimento do CMTN. Além disso, a deleção de UBR5 mediada por CRISPR/Cas9 mostrou inibição significativa da metástase e do crescimento do CMTN em modelos experimentais de camundongos. Ademais, a inclusão de UBR5 em um modelo de camundongo selvagem restaurou sua funcionalidade completa, enquanto esse efeito não foi observado em linhagens mutantes inativadas (Liao et al., 2017). A ausência de UBR5 está associada ao aumento da apoptose, necrose e inibição do crescimento tumoral no câncer de mama triplo negativo (CMTN) devido à angiogênese deficiente. Devido à perda de UBR5, a disseminação tumoral para órgãos distantes é reduzida, e o UBR5 induz a transição epitélio-mesenquimal (TEM) anormal, principalmente pela redução da expressão de E-caderina (Zhang e Weinberg, 2018). Recentemente, demonstrou-se que o UBR5 é um fator muito importante na transcrição de PD-L1 induzida por IFN-γ no CMTN, devido à sua falta de atividade de ubiquitinação E3. A análise do transcriptoma de RNA revelou que o UBR5 pode ter efeitos sistêmicos em genes associados à via do IFN-γ e promover a transativação de PD-L1, aumentando os níveis de ativação da proteína quinase A (PKR) e seus transdutores de sinal e ativadores de transcrição 1 (STAT1) e fator regulador de interferon 1 (IRF1). No entanto, a ablação combinada da expressão de UBR5 e PD-L1 mediada por CRISPR/Cas9 apresenta um efeito terapêutico sinérgico superior ao bloqueio isolado de cada um, com efeitos profundos no microambiente tumoral (Wu et al., 2022). Assim, o CRISPR/Cas9 pode ser uma ferramenta importante para inibir a função de UBR5, suprimindo, dessa forma, a metástase e o crescimento tumoral do câncer de mama triplo-negativo.
ROR1 é uma proteína transmembranar do tipo I que se expressa durante o câncer e o desenvolvimento embrionário, tendo sido identificada como uma proteína oncofetal (Nicholas Borcherding, 2014). O comportamento invasivo de vários tipos de câncer humano está associado à superexpressão de ROR1. Resultados promissores foram obtidos em estudos in vivo e in vitro envolvendo compostos terapêuticos direcionados a ROR1 (Chien et al., 2016). Níveis elevados de mRNA de ROR1 em biópsias de tecido mamário também foram associados a tumores agressivos do tipo basal (BL) e à sua migração para outras partes do corpo. Além disso, a superexpressão de ROR1 foi identificada como um marcador prognóstico para o desenvolvimento de câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Chien et al., 2016). Portanto, o silenciamento de ROR1 utilizando CRISPR/Cas9 para suprimir o crescimento e a metástase do CMTN seria uma estratégia eficaz.
O processo de sialilação envolve a adição de ácido siálico a glicoconjugados, catalisada por sialiltransferases (STs). A ST8SIA1 pertence à família ST e desempenha um papel importante na patogênese de várias doenças, como leucemia linfocítica e câncer colorretal (Chang et al., 2018). A análise da sequência de RNA mostra que a ST8SIA1 é altamente expressa no tecido mamário de pacientes com câncer de mama triplo-negativo (CMTN) e está positivamente correlacionada com mutações no gene supressor tumoral p53, o que pode contribuir para a patogênese do CMTN (Battula et al., 2017). Além disso, a ST8SIA1 está envolvida na metástase e recorrência do CMTN, sugerindo que desempenha um papel importante na ocorrência e desenvolvimento dessa doença. Em um modelo in vitro de CMTN, o silenciamento da ST8SIA1 por CRISPR/Cas9 demonstrou bloquear o crescimento e a metástase (Battula et al., 2017). Isso sugere que o CRISPR/Cas9 pode ser uma ferramenta importante para inibir a função do oncogene ST8SIA1 no tratamento do câncer de mama triplo negativo.
A NAT1 é uma enzima metabólica que catalisa a formação de compostos xenobióticos de fase II e é expressa em quase todos os tecidos humanos. A NAT1 pode utilizar o cofator folato para direcionar a acetil-CoA (acetil-CoA) mesmo na ausência do substrato amina aromática (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Estudos demonstraram que a NAT1 regula a função da metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) em modelos de células de câncer de mama e protege contra espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a privação de glicose (Wang et al., 2018). A deleção da NAT1 demonstrou inibir o complexo da piruvato desidrogenase, levando à disfunção mitocondrial (Wang L. et al., 2019). Além disso, diversos outros estudos mostraram que a inibição da NAT1 utilizando pequenas moléculas e silenciamento por siRNA pode reduzir a invasividade e a proliferação de células de câncer de mama (Stepp et al., 2018). Recentemente, a tecnologia CRISPR/Cas9 foi utilizada para suprimir a expressão de NAT1 na linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231, afetando o metabolismo celular de acordo com seu nível de expressão. Este estudo também demonstrou que NAT-1 é crucial para a progressão e metástase do câncer de mama triplo-negativo (Carlisle et al., 2020).
A transcrição coordenada de oncogenes é regulada por superenhancers, fatores de transcrição e cofatores (Hnisz et al., 2015). Além disso, um grupo de quinases dependentes de ciclina (CDKs), como CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 e CDK13, é necessário para a regulação transcricional. Entre elas, a CDK7 está envolvida na fosforilação da RNA polimerase II, que é muito importante para a iniciação e expansão da transcrição de oncogenes na patogênese do câncer de mama triplo negativo (CMTN). Em um estudo seminal, a deleção de CDK7 por CRISPR/Cas9 inibiu o CMTN, indicando que a patogênese do CMTN é dependente de CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Estudos demonstraram que mutações em MYC e RBP (proteína de ligação ao RNA) podem levar à apoptose, enquanto mutações em um único gene, MYC ou RBP, não afetam o crescimento de células cancerígenas (Einstein et al., 2021). Mais de 1000 RBPs no genoma humano foram triadas usando uma biblioteca baseada em CRISPR/Cas9. Entre elas, 57 RBPs foram consideradas essenciais para o crescimento de células cancerígenas com níveis elevados de MYC (Wheeler et al., 2020). Além disso, YTHDF2 é importante para manter o crescimento de células de câncer de mama triplo-negativo (CMTN) e reduz a quantidade de transcritos metilados durante a transcrição e tradução em alto nível em células cancerígenas com maior expressão de MYC. Ademais, YTHDF2 não é essencial para células cancerígenas menos dependentes de níveis elevados de MYC para prolongar a sobrevida de pacientes com CMTN (Einstein et al., 2021), sugerindo que pode ser um alvo terapêutico potencial para medicamentos que possam combater o CMTN.
As proteínas de dedo de zinco (ZNFs) constituem aproximadamente 1% do genoma humano total. Estudos demonstraram que as ZNFs podem regular a proliferação celular em diversos tipos de câncer, como câncer de fígado, câncer de mama e câncer colorretal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliotecas geradas por nocaute CRISPR foram utilizadas para rastrear diversos genes supressores de tumor (GSTs) em células de câncer de mama (Shalem et al., 2014). Desde então, um estudo transcriptômico de células de câncer de mama com deleção do gene ZNF319 por CRISPR/Cas9 mostrou que o ZNF319 é ​​um gene supressor de tumor que reduz a proliferação do câncer de mama e, portanto, está envolvido em diversos mecanismos de sinalização potenciais e outras funções biológicas (Wang L. et al., 2022).
A ferroptose é um tipo de morte celular programada dependente da presença de ferro. Sabe-se que o desenvolvimento da ferroptose é influenciado pela presença de peróxidos lipídicos. Além disso, foi relatado que a PKCβII exibe peroxidação lipídica precoce, e o aumento da peroxidação lipídica está associado à ferroptose. A triagem de uma biblioteca de inibidores de quinase mediados por CRISPR/Cas9 revelou que a PKCβII está envolvida no processo de peroxidação lipídica, que é crucial para a ferroptose em células MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Portanto, isso sugere que a inativação da PKCβII por CRISPR/Cas9 pode ser um alvo potencial para genes supressores de tumor no tratamento de doenças relacionadas à ferroptose (Zhang et al., 2022).
Acredita-se que a resistência a medicamentos seja responsável por aproximadamente 90% das mortes em pacientes com câncer e representa um dos maiores desafios no tratamento oncológico (Bukowski et al., 2020). Os resultados indicam que um número suficiente de genes relacionados ao efluxo de fármacos, reparo do DNA, apoptose e diversas vias de sinalização celular estão associados à resistência a medicamentos (Haider et al., 2020). Entre eles, vários genes foram alvos da tecnologia CRISPR/Cas9 e demonstraram resultados promissores na redução da resistência a medicamentos e no aumento da eficácia dos tratamentos anticancerígenos (Vaghari-Tabari et al., 2022). Além disso, bibliotecas de triagem de nocaute gênico de alto rendimento por CRISPR/Cas9 têm se mostrado eficazes na modificação da função de potenciais genes-alvo de resistência a medicamentos (Shalem et al., 2015). Para identificar genes de resistência ao paclitaxel, o sequenciamento de RNA, juntamente com a triagem de bibliotecas de sgRNA em todo o genoma, foi usado para identificar oito genes candidatos, incluindo a histona desacetilase 9 (HDAC9), que estão associados à resistência a medicamentos em pacientes com câncer de mama triplo-negativo recorrente (B et al., 2020). Em outro estudo, observou-se aumento da expressão da proteína quinase de diserina/treonina e tirosina (DSTYK) durante a sobrevida de pacientes com câncer de mama triplo-negativo tratados com medicamentos anticancerígenos. Além disso, o silenciamento de DSTYK mediado por CRISPR/Cas9 aumentou significativamente a apoptose de células cancerígenas resistentes a medicamentos in vitro (células SUM102PT e células MDA-MB-468) e em um modelo de câncer de mama triplo-negativo in vivo (Ogbu et al., 2021).
Embora o câncer de mama triplo negativo (CMTN) apresente ativação anormal da via MAPK, o efeito clínico das terapias direcionadas à MEK é limitado. Uma triagem genômica com CRISPR/Cas9 revelou que a inibição da PSMG2 (chaperona 2 da montagem do proteoma) sensibiliza as células BT549 e MB468 de CMTN ao inibidor de MEK AZD6244. O silenciamento da PSMG2 por CRISPR/Cas9 alterou a função normal do proteassoma, levando à desmontagem da PDPK1 mediada por autofagia, melhorando ainda mais as células tumorais em modelos murinos de CMTN induzidos por AZD6244 (inibidor de MEK) e MG132 (inibidor de proteassoma). Portanto, inibidores de proteassoma e de MAP quinase (MEK) podem ser administrados sinergicamente para reduzir a proliferação de células tumorais (Wang X. et al., 2022).
A tecnologia CRISPR/Cas9 também foi utilizada para rastrear a perda de função gênica que leva à resistência ao câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Shu et al., 2020). Ge et al. explicaram o mecanismo de resistência a medicamentos em células cancerígenas tratadas com JQ1, um inibidor do domínio bromodomain BET (BBDI), no CMTN. Utilizando CRISPR/Cas9, eles descobriram que a deleção do gene rb1 fazia com que o CMTN se tornasse resistente ao medicamento antitumoral JQ1. Portanto, a função do rb1 é importante na resposta aos medicamentos JQ1 no CMTN. Eles também relataram que o paclitaxel é um inibidor da quinase CDK4/6/microtúbulos e que sua combinação com BBDIs, como o JQ1, pode proporcionar respostas terapêuticas promissoras para o CMTN resistente a medicamentos (Ge et al., 2020).
O perfil transcricional de RNAs não codificantes longos (lncRNAs) tem sido apontado como responsável pela resistência à terapia neoadjuvante em câncer de mama triplo-negativo (CMTN). Este estudo demonstra que cinco transcritos diferentes de lncRNA do gene MALAT1 apresentam alta expressão em CMTN. Além disso, a deleção de MALAT1 mediada por CRISPR/Cas9 aumentou a sensibilidade das células BT-549 de CMTN ao paclitaxel e à doxorrubicina, sugerindo um possível papel do MALAT1 na resistência ao CMTN (Shaath et al., 2021).
Mutações no gene BRCA1 (BRCA1m) são heterogêneas e, portanto, difíceis de detectar. O direcionamento da PARP1 (poli(ADP-ribose) polimerase), o parceiro sintético letal da BRCA1, pode aumentar a quimiossensibilidade a medicamentos no câncer de mama triplo-negativo (CMTN). Utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, a deleção da PARP1 aumentou a sensibilidade de fármacos anticancerígenos como doxorrubicina, gencitabina e docetaxel em células de CMTN com mutação no gene BRCA1 (mBRCA1), sugerindo que a PARP1 também está envolvida na resistência a medicamentos no CMTN (Vaghari-Tabari et al., 2022). Sabe-se que mutações nos genes supressores de tumor BRCA1 ou BRCA2 aumentam a probabilidade de desenvolvimento de câncer de mama em humanos. O tratamento desses pacientes requer o uso de inibidores de PARP. Além disso, foi demonstrado que a eliminação do fator de salvamento de nucleotídeos DNPH1 usando CRISPR/Cas9 pode remover o nucleotídeo tóxico 5-hidroximetildeoxiuridina (hmdU) monofosfato, aumentando assim a resposta das células deficientes em BRCA à sensibilidade aos inibidores de PARP (Fugger et al., 2021). Portanto, CRISPR/Cas9 e inibidores de PARP1 podem se tornar uma importante estratégia de tratamento para o câncer de mama triplo negativo.
O gene da glicoproteína penetrante (P-gp) é um gene de resistência a múltiplos fármacos que geralmente apresenta expressão aumentada em aproximadamente 41% de todos os casos de câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Sun et al., 2020). O efluxo de fármacos induzido pela P-gp foi identificado como um regulador chave da resistência a fármacos no câncer de mama. Inibidores da P-gp demonstraram aumentar a sensibilidade a fármacos anticancerígenos no câncer de mama (Famta et al., 2021). Portanto, a ablação ou supressão da P-gp mediada por CRISPR/Cas9 e seus inibidores podem ser métodos muito importantes para superar a resistência a fármacos no CMTN.
Sabe-se que o transportador ABCG2 (transportador de cassete de ligação a ATP G2) causa resistência a medicamentos no câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Palasuberniam et al., 2015), embora atualmente não existam relatos sobre a relação entre o silenciamento do ABCG2 por CRISPR/Cas9 e a inativação de genes supressores de tumor. O PTEN pode potencializar a ativação do ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015; Deepak Singh et al., 2021). Portanto, o uso do CRISPR/Cas9 para remover o ABCG2, combinado com um inibidor de ABCG2, pode ser um tratamento adequado para superar a resistência a medicamentos no CMTN. A Tabela 2 menciona o direcionamento do CRISPR/Cas9 a todos os genes de resistência.
Tabela 2. O CRISPR/Cas9 tem como alvo vários genes de resistência ao câncer de mama triplo negativo para sensibilizar as células a medicamentos anticancerígenos.
As bibliotecas CRISPR/Cas9 são ferramentas potenciais para a triagem de mutações genéticas associadas à patogênese do câncer (Chan et al., 2022). Esse método de triagem envolve quatro etapas: (a) construção da biblioteca, (b) transdução lentiviral, (c) triagem fenotípica e (d) análise do gene alvo. Embora o câncer de mama triplo negativo (CMTN) apresente ativação anormal da via MAPK, o prognóstico clínico da terapia direcionada ao MEK para pacientes com CMTN portadores de mutações em genes supressores de tumor, como PTEN, RB1 e TP53, é muito ruim.
Adicionalmente, uma triagem de nocaute gênico utilizando CRISPR/Cas9 testou a molécula mais potente e seletiva, o deidrocatrol, abundante em extratos de flores e folhas da Guatemala, para compreender o efeito do deidrocatrol em células MDA-MB-231. Mecanismos de citotoxicidade celular seletiva. Características de células-tronco mesenquimais de subtipos de câncer de mama triplo-negativo (CMTN). Essa triagem baseada em CRISPR/Cas9 também revelou que o gene HSD17B11, que codifica a 17β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 11, é altamente expresso em células MDA-MB-231 e resulta na produção de deidrofalcarinol específico para essas células (Grant et al., 2020). Assim, isso sugere que a triagem genômica por CRISPR/Cas9 tem grande potencial para identificar os mecanismos subjacentes às propriedades anticancerígenas de potenciais compostos naturais.
Além disso, a vulnerabilidade do câncer de mama triplo negativo (CMTN) ao câncer foi estudada usando uma triagem CRISPR/Cas9 in vivo em todo o genoma, que mostrou uma ligação entre vias oncogênicas e supressoras de tumor. Componentes-chave das vias mTOR e Hippo têm demonstrado desempenhar papéis importantes na regulação tumoral no CMTN. Adicionalmente, estudos mostraram que a inibição farmacológica de mTORC1/2 e da oncoproteína YAP inibe efetivamente a patogenicidade do CMTN usando um modelo de sinergia droga-matriz in vitro e xenotransplantes derivados de pacientes in vivo. Além disso, a inibição de mTORC1/2 mediada por Torin-1 aumenta a macropinocitose, enquanto a inibição de YAP induzida por verteporfina leva à morte celular do CMTN. Em conjunto, esses resultados destacam o poder e a robustez da triagem CRISPR in vivo em todo o genoma para identificar tratamentos novos e eficazes para o CMTN (Dai et al., 2021).
A desregulação do sistema imunológico é um fator importante na tumorigênese. As células cancerígenas escapam da eliminação imunológica contornando os mecanismos de defesa, inclusive interferindo na atividade das células imunes no microambiente tumoral e comprometendo o sistema imunológico. Portanto, o desenvolvimento de um sistema imunológico mais eficiente pode ser uma abordagem fundamental para o combate aos tumores. O uso da modificação genética baseada em CRISPR/Cas9 aborda diversas questões relacionadas à disfunção imunológica sob diferentes perspectivas. O CRISPR/Cas9 tem sido utilizado para melhorar a imunidade antitumoral contra o câncer de mama por meio das seguintes vias (Figura 3).
Figura 3. A imunoterapia CRISPR/Cas9 tem como alvo células de câncer de mama triplo-negativo (CMTN). A perda de CDK5 e a redução da expressão de PDL1 e CD155 potencializam o sistema imunológico. Da mesma forma, a perda de A2AR e a redução da expressão de antígenos associados a tumores (TAAs), como HER2, mucina 1 e TEM8, aumentam a eficiência das células CAR-T na destruição de células cancerígenas. A triagem de células T mediada por CRISPR/Cas9 demonstrou que a interrupção da quinase p38 aumenta a atividade antitumoral das células T. As células T modificadas por CRISPR/Cas9 apresentam aumento na expressão do receptor de células T (TCR), resultando em atividade antitumoral.
O objetivo da imunoterapia é estimular o sistema imunológico a atacar as células cancerígenas. A superexpressão de proteínas de checkpoint imunológico geralmente previne reações autoimunes, mas pode ajudar os cânceres a evitá-las (Topalian et al., 2015). Essas proteínas previnem reações imunológicas ligando-se a receptores na superfície das células imunes. Múltiplas proteínas de checkpoint (como CD155 e PD-L1) têm como alvo o receptor PD-1 nas células imunes e são expressas no câncer de mama, especialmente no câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Li Y.-C. et al., 2020). O silenciamento do PD-L1 ou de seu receptor usando CRISPR/Cas9 pode estimular o sistema imunológico a atacar tumores de CMTN (Yahata et al., 2019). Além disso, a redução da expressão de PD-L1 por meio da deleção de CDK5 mediada por CRISPR/Cas9 demonstrou inibir o crescimento tumoral in vitro e in vivo (Deng et al., 2020). A inibição do crescimento em modelos in vitro e in vivo de câncer de mama sugere que a redução do CD155 mediada por shRNA pode ter um efeito terapêutico no câncer de mama (Gao et al., 2018).
As células CAR-T expressam CARs que reconhecem antígenos associados a tumores (TAAs) e podem usar a supressão de proteínas de checkpoint para aumentar sua atividade (Li C. et al., 2020). Existem vários alvos potenciais para a terapia com células CAR-T no câncer de mama, incluindo diversos TAAs, como HER2, mucina-1 e TEM8 (Bajgain et al., 2018). Há evidências de que as células CAR-T direcionadas à mesotelina (superexpressa em células BT-459 de câncer de mama triplo-negativo) são mais eficazes contra o câncer quando o PD-1 é inativado usando CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). No entanto, isolar células T de pacientes e editá-las ex vivo é um processo trabalhoso e demorado. Embora células T universais possam reduzir os requisitos de isolamento, as células T do doador que expressam antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I e receptor de células T (TCR) devem ser removidas para evitar anormalidades do enxerto contra o hospedeiro (Ren et al., 2017). , 2017a). Usando CRISPR/Cas9, a HDR pode eliminar simultaneamente o TCR e o HLA e inativar o gene que codifica o CAR. Estudos mostraram que o CRISPR/Cas9 pode ser usado para introduzir CARs anti-CD19 no lócus do TCR, produzindo CARs de forma eficiente sem depleção de células T (Dimitri et al., 2022). Tecnologias multiplex foram desenvolvidas para gerar células T CAR alogênicas por meio da eliminação simultânea do TCR, da beta-2-microglobulina (B2M), da subunidade HLA-I e de outras proteínas, como PD-1 e CTLA-4, o que pode conferir maiores propriedades anticancerígenas contra o câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
O uso da tecnologia CRISPR/Cas9 pode melhorar a eficácia das células CAR-T. Sabe-se que a adenosina possui propriedades imunossupressoras e pode reduzir a imunidade antitumoral ao bloquear a função das células T e ativar os receptores de adenosina A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). O silenciamento do A2AR utilizando CRISPR/Cas9 melhorou significativamente a eficácia das células CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). As células T apresentam diversas características fenotípicas, como expansão celular, diferenciação, estresse oxidativo e estresse genômico. A triagem de células T baseada em CRISPR/Cas9 revelou a disrupção de 25 diferentes quinases do receptor de células T. Entre elas, a deleção da quinase p38 demonstrou aumentar a atividade antitumoral das células T, indicando que a quinase p38 é um regulador chave da regulação das células CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
As células T podem ser geneticamente modificadas usando CRISPR/Cas9 para produzir TCRs altamente expressos. A transferência de células T geneticamente modificadas para pacientes demonstrou atividade antitumoral mais forte do que as células T endógenas. Portanto, os TCRs endógenos podem competir com os TCRs geneticamente alterados nos pacientes, o que pode impactar o potencial da imunoterapia do câncer. Para superar esse problema, o uso de CRISPR/Cas9 para remover o TCR-β endógeno nas células receptoras e, subsequentemente, transferir células T com TCR-β para pacientes com câncer pode exibir melhores respostas imunes antitumorais sem a necessidade de competição sexual com TCRs endógenos (Fan et al., 2018). Assim, com exceção das células T modificadas por CRISPR, os TCRs são mil vezes mais sensíveis a antígenos tumorais do que as células T transduzidas com TCR normal. Além disso, em várias leucemias, as células T alteradas geradas por CRISPR com TCR γδ exibem maior expressão de células T CD4+ e CD8+ do que a transferência de TCR padrão (Legut et al., 2018). Assim, as células T modificadas geradas por CRISPR/Cas9 podem ser um método de imunoterapia eficaz para combater o câncer de mama triplo negativo.
As integrinas são moléculas de adesão celular presentes nas membranas transmembranares das células e promovem a ligação das células à matriz extracelular (MEC) (Hamidi e Ivaska, 2018). A desregulação das integrinas está associada ao desenvolvimento e à migração do câncer, alterando a matriz extracelular e levando à sobrevivência das células cancerígenas na circulação (Hamidi e Ivaska, 2018). O silenciamento das integrinas mediado por CRISPR/Cas9 retarda a progressão tumoral, a metástase e a colonização no câncer de mama triplo-negativo (CMTN). O silenciamento da integrina α5 (ITGA5) demonstrou reduzir a migração e a progressão celular em outros tipos de câncer, como o câncer de pulmão (Ju et al., 2017), sugerindo que a integrina α5 também pode ser um fator chave na patogênese do CMTN.
A geração de camundongos knockout utilizando métodos tradicionais com células-tronco embrionárias (ES) é um processo trabalhoso, demorado e ineficiente. Leva meses e anos para direcionar as células ES por meio de recombinação homóloga, criar camundongos quiméricos e, em seguida, cruzá-los com camundongos heterozigotos para produzir descendentes homozigotos. Cruzamentos complexos são necessários para criar camundongos com múltiplas mutações genéticas. No entanto, muitos problemas surgiram ao usar camundongos gerados pela ablação de células ES utilizando CRISPR/Cas9 ou pela microinjeção de componentes CRISPR/Cas9 em óvulos fertilizados unicelulares. Por exemplo, a introdução de alterações frequentemente ocorre em loci bialélicos e não é específica para um gene. Recentemente, foi relatado que células ES utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9 podem inserir simultaneamente mutações bialélicas em até 5 genes (Nishizono et al., 2021). Para esse fim, mRNA de Cas9 e cinco gRNAs específicos para genes foram transfectados simultaneamente em células ES. Isso destaca o potencial e a eficácia desse procedimento, embora essas mutações possam ter sido transmitidas quando as linhagens fundadoras foram cruzadas para produzir camundongos com deleção quíntupla. O estudo também relata uma descoberta surpreendente: as células-tronco embrionárias (ES) não são mais necessárias para criar camundongos geneticamente modificados. Em vez disso, para remover produtos gênicos específicos, mRNA e gRNA da Cas9 foram injetados em embriões em estágio unicelular. Como resultado, linhagens fundadoras com deleção gênica foram criadas e podem, teoricamente, ser usadas para estudar as consequências da deleção de genes em camundongos (Qin et al., 2016). Assim, o CRISPR/Cas9 permite a criação de camundongos transgênicos para tratar o câncer de mama triplo-negativo (CMTN) a um custo menor do que a engenharia genética tradicional. Usando o sistema CRISPR/Cas, um novo modelo de camundongo com deleção gênica foi desenvolvido, capaz de introduzir com sucesso mutações pontuais em um ou mais genes endógenos no CMTN. Com base nesse conceito, modelos animais de TNBC também podem ser desenvolvidos usando a deleção mediada por CRISPR/Cas9 de BRCA1 e p53, resultando em perda de reparo por HR, instabilidade genômica e fenótipos mutantes ( Annunziato et al., 2020 ).
Atualmente, diversos métodos, como mamografia, ressonância magnética (RM) e ultrassonografia, são utilizados para diagnosticar o câncer de mama triplo negativo (CMTN). No entanto, esses métodos apresentam algumas limitações. A mamografia é utilizada para diagnosticar o tecido mamário local, e não metástases, onde as células cancerígenas migraram para outros órgãos. A ultrassonografia não é um método confiável para o diagnóstico de CMTN (Chen e Lee-Felker, 2023). A RM possui maior sensibilidade do que a ultrassonografia e a mamografia, mas sua precisão diagnóstica é limitada (Sha e Chen, 2022). A biópsia tecidual é um método invasivo para identificar células cancerígenas. Contudo, em alguns casos, a biópsia pode não detectar tecido cancerígeno se a agulha se desviar da área de interesse. Além disso, é um procedimento muito caro e pode ser traumático para a paciente. O CMTN é um tipo de câncer heterogêneo, portanto, uma biópsia pode não fornecer informações suficientes sobre o tipo de câncer. Assim, um novo método diagnóstico confiável para a detecção do CMTN é urgentemente necessário. O CRISPR/Cas9 pode servir como uma alternativa altamente sensível e minimamente invasiva para o diagnóstico do câncer de mama. Para tanto, estratégias baseadas em CRISPR/Cas9 podem ser utilizadas para aprimorar os métodos de PCR para o diagnóstico do câncer de mama triplo-negativo (CMTN). Primeiramente, as proteínas Cas9 e cpf1 do sistema CRISPR são utilizadas para remover o DNA não específico, e então essas duas proteínas (Cas9 e cpf1) podem reconhecer a sequência PAM antes de se ligarem ao DNA alvo (Deepak Singh et al., 2021). Assim, a PCR pode identificar mutações associadas ao desenvolvimento do câncer. Diversos estudos adotaram essa estratégia baseada em CRISPR para detectar diferentes mutações em diferentes tipos de câncer (Safari et al., 2019). Portanto, os métodos de PCR baseados em CRISPR podem reduzir a dependência do diagnóstico de CMTN em métodos invasivos, como a imuno-histoquímica baseada em biópsia.
Alterações genotípicas na regulação de receptores hormonais também foram demonstradas em câncer de mama triplo-negativo (CMTN) (Chen e Russo, 2009). Estratégias de PCR baseadas em CRISPR/Cas9, utilizando microarrays para diagnóstico no ponto de atendimento, podem monitorar essas mutações de forma eficaz (Hajian et al., 2019). Isso também pode fornecer aos profissionais de saúde informações relevantes sobre mutações específicas em pacientes com CMTN, o que pode ajudar a melhorar o tratamento. No entanto, essa técnica combinada apresenta limitações. Portanto, são necessários extensos esforços de pesquisa antes que esse método CRISPR/Cas-PCR possa ser utilizado na área da saúde para o diagnóstico de CMTN (Yang et al., 2019).