O diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares identificados por tomografia computadorizada (TC) continua sendo um desafio na prática clínica.Aqui, caracterizamos o metaboloma global de 480 amostras de soro, incluindo controles saudáveis, nódulos pulmonares benignos e adenocarcinoma pulmonar em estágio I.Os adenocarcinomas apresentam perfis metabolômicos únicos, enquanto nódulos benignos e indivíduos saudáveis apresentam alta similaridade nos perfis metabolômicos.No grupo descoberta (n = 306), foi identificado um conjunto de 27 metabólitos para diferenciar nódulos benignos de malignos.A AUC do modelo discriminante nos grupos de validação interna (n = 104) e validação externa (n = 111) foi de 0,915 e 0,945, respectivamente.A análise da via revelou aumento de metabólitos glicolíticos associados à diminuição do triptofano no soro do adenocarcinoma de pulmão em comparação com nódulos benignos e controles saudáveis, e sugeriu que a captação de triptofano promove a glicólise em células de câncer de pulmão.Nosso estudo destaca o valor dos biomarcadores metabólicos séricos na avaliação do risco de nódulos pulmonares detectados pela TC.
O diagnóstico precoce é fundamental para melhorar as taxas de sobrevivência de pacientes com câncer.Os resultados do National Lung Cancer Screening Trial (NLST) dos EUA e do European NELSON Study demonstraram que o rastreio com tomografia computorizada de baixa dose (LDCT) pode reduzir significativamente a mortalidade por cancro do pulmão em grupos de alto risco1,2,3.Desde o uso generalizado da TCBD para rastreamento do câncer de pulmão, a incidência de achados radiográficos incidentais de nódulos pulmonares assintomáticos continuou a aumentar 4 .Nódulos pulmonares são definidos como opacidades focais de até 3 cm de diâmetro 5 .Enfrentamos dificuldades em avaliar a probabilidade de malignidade e lidar com o grande número de nódulos pulmonares detectados incidentalmente na TCBD.As limitações da TC podem levar a exames de acompanhamento frequentes e resultados falso-positivos, levando a intervenções desnecessárias e tratamento excessivo6.Portanto, há necessidade de desenvolver biomarcadores confiáveis e úteis para identificar corretamente o câncer de pulmão nos estágios iniciais e diferenciar a maioria dos nódulos benignos na detecção inicial 7 .
A análise molecular abrangente do sangue (soro, plasma, células mononucleares do sangue periférico), incluindo genómica, proteómica ou metilação do ADN8,9,10, levou a um interesse crescente na descoberta de biomarcadores diagnósticos para o cancro do pulmão.Enquanto isso, as abordagens metabolômicas medem os produtos finais celulares que são influenciados por ações endógenas e exógenas e, portanto, são aplicadas para prever o início e o resultado da doença.A espectrometria de massa em tandem com cromatografia líquida (LC-MS) é um método amplamente utilizado para estudos metabolômicos devido à sua alta sensibilidade e grande faixa dinâmica, que pode abranger metabólitos com diferentes propriedades físico-químicas11,12,13.Embora a análise metabolômica global de plasma/soro tenha sido usada para identificar biomarcadores associados ao diagnóstico de câncer de pulmão14,15,16,17 e à eficácia do tratamento,18 os classificadores de metabólitos séricos para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos ainda precisam ser muito estudados.-pesquisa massiva.
O adenocarcinoma e o carcinoma de células escamosas são os dois principais subtipos de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).Vários exames de rastreamento por TC indicam que o adenocarcinoma é o tipo histológico mais comum de câncer de pulmão1,19,20,21.Neste estudo, utilizamos cromatografia líquida de ultra-eficiência e espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS) para realizar análise metabolômica em um total de 695 amostras de soro, incluindo controles saudáveis, nódulos pulmonares benignos e TC detectados ≤3 cm.Rastreamento de adenocarcinoma pulmonar em estágio I.Identificamos um painel de metabólitos séricos que distinguem o adenocarcinoma pulmonar de nódulos benignos e controles saudáveis.A análise de enriquecimento da via revelou que o metabolismo anormal do triptofano e da glicose são alterações comuns no adenocarcinoma pulmonar em comparação com nódulos benignos e controles saudáveis.Por fim, estabelecemos e validamos um classificador metabólico sérico com alta especificidade e sensibilidade para distinguir entre nódulos pulmonares malignos e benignos detectados pela TCBD, o que pode auxiliar no diagnóstico diferencial precoce e na avaliação de risco.
No presente estudo, amostras de soro pareadas por sexo e idade foram coletadas retrospectivamente de 174 controles saudáveis, 292 pacientes com nódulos pulmonares benignos e 229 pacientes com adenocarcinoma pulmonar em estágio I.As características demográficas dos 695 indivíduos são mostradas na Tabela Suplementar 1.
Como mostrado na Figura 1a, um total de 480 amostras de soro, incluindo 174 amostras de controle saudável (HC), 170 nódulos benignos (BN) e 136 amostras de adenocarcinoma pulmonar em estágio I (LA), foram coletadas no Sun Yat-sen University Cancer Center.Coorte de descoberta para perfil metabolômico não direcionado usando cromatografia líquida de ultra-desempenho e espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS).Como mostrado na Figura Suplementar 1, metabólitos diferenciais entre LA e HC, LA e BN foram identificados para estabelecer um modelo de classificação e explorar ainda mais a análise diferencial da via.104 amostras coletadas pelo Sun Yat-sen University Cancer Center e 111 amostras coletadas por outros dois hospitais foram submetidas à validação interna e externa, respectivamente.
a População de estudo na coorte de descoberta que foi submetida à análise metabolômica sérica global usando cromatografia líquida de ultra-desempenho e espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS).b Análise discriminante parcial de mínimos quadrados (PLS-DA) do metaboloma total de 480 amostras de soro da coorte do estudo, incluindo controles saudáveis (HC, n = 174), nódulos benignos (BN, n = 170) e adenocarcinoma pulmonar em estágio I (Los Angeles, n = 136).+ESI, modo de ionização por eletrospray positivo, -ESI, modo de ionização por eletrospray negativo.c – e Metabólitos com abundâncias significativamente diferentes em dois grupos (teste de classificação sinalizada de Wilcoxon bicaudal, valor de p ajustado para taxa de descoberta falsa, FDR <0,05) são mostrados em vermelho (alteração de dobra> 1,2) e azul (alteração de dobra <0,83) .) mostrado no gráfico do vulcão.f Mapa de calor de agrupamento hierárquico mostrando diferenças significativas no número de metabólitos anotados entre LA e BN.Os dados de origem são fornecidos na forma de arquivos de dados de origem.
O metaboloma sérico total de 174 HC, 170 BN e 136 LA no grupo de descoberta foi analisado utilizando análise UPLC-HRMS.Primeiro mostramos que as amostras de controle de qualidade (CQ) se agrupam firmemente no centro de um modelo não supervisionado de análise de componentes principais (PCA), confirmando a estabilidade do desempenho do estudo atual (Figura 2 suplementar).
Conforme mostrado na análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) na Figura 1b, descobrimos que havia diferenças claras entre LA e BN, LA e HC nos modos de ionização por eletrospray positivo (+ESI) e negativo (-ESI). .isolado.No entanto, não foram encontradas diferenças significativas entre BN e HC nas condições +ESI e -ESI.
Encontramos 382 características diferenciais entre LA e HC, 231 características diferenciais entre LA e BN e 95 características diferenciais entre BN e HC (teste de classificação sinalizada de Wilcoxon, FDR <0,05 e alteração múltipla> 1,2 ou <0,83) (Figura .1c-e )..Os picos foram ainda anotados (Dados Suplementares 3) contra um banco de dados (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) por valor m/z, tempo de retenção e pesquisa de espectro de massa de fragmentação (detalhes descritos na seção Métodos) 22.Finalmente, 33 e 38 metabólitos anotados com diferenças significativas na abundância foram identificados para LA versus BN (Figura 1f e Tabela Suplementar 2) e LA versus HC (Figura 3 Complementar e Tabela Suplementar 2), respectivamente.Em contraste, apenas 3 metabólitos com diferenças significativas na abundância foram identificados em BN e HC (Tabela Suplementar 2), consistente com a sobreposição entre BN e HC em PLS-DA.Esses metabólitos diferenciais cobrem uma ampla gama de produtos bioquímicos (Figura 4 suplementar).Tomados em conjunto, estes resultados demonstram alterações significativas no metaboloma sérico que refletem a transformação maligna do câncer de pulmão em estágio inicial em comparação com nódulos pulmonares benignos ou indivíduos saudáveis.Enquanto isso, a semelhança do metaboloma sérico de BN e HC sugere que nódulos pulmonares benignos podem compartilhar muitas características biológicas com indivíduos saudáveis.Dado que as mutações do gene do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) são comuns no adenocarcinoma pulmonar subtipo 23, procuramos determinar o impacto das mutações condutoras no metaboloma sérico.Analisamos então o perfil metabolômico geral de 72 casos com status de EGFR no grupo de adenocarcinoma pulmonar.Curiosamente, encontramos perfis comparáveis entre pacientes mutantes de EGFR (n = 41) e pacientes de tipo selvagem de EGFR (n = 31) na análise de PCA (Figura 5a suplementar).No entanto, identificamos 7 metabólitos cuja abundância foi significativamente alterada em pacientes com mutação de EGFR em comparação com pacientes com EGFR de tipo selvagem (teste t, p <0,05 e alteração de dobra> 1,2 ou <0,83) (Figura 5b suplementar).A maioria destes metabolitos (5 em 7) são acilcarnitinas, que desempenham um papel importante nas vias de oxidação dos ácidos gordos.
Conforme ilustrado no fluxo de trabalho mostrado na Figura 2a, os biomarcadores para classificação de nódulos foram obtidos usando operadores de contração mínima absoluta e seleção com base em 33 metabólitos diferenciais identificados em LA (n = 136) e BN (n = 170).Melhor combinação de variáveis (LASSO) – modelo de regressão logística binária.A validação cruzada de dez vezes foi usada para testar a confiabilidade do modelo.A seleção de variáveis e a regularização de parâmetros são ajustadas por uma penalidade de maximização de verossimilhança com parâmetro λ24.A análise metabolômica global foi realizada de forma independente nos grupos de validação interna (n = 104) e validação externa (n = 111) para testar o desempenho de classificação do modelo discriminante.Como resultado, 27 metabólitos no conjunto de descoberta foram identificados como o melhor modelo discriminante com o maior valor médio de AUC (Fig. 2b), entre os quais 9 tiveram atividade aumentada e 18 diminuíram a atividade em LA em comparação com BN (Fig. 2c).
Fluxo de trabalho para a construção de um classificador de nódulos pulmonares, incluindo a seleção do melhor painel de metabólitos séricos no conjunto de descoberta usando um modelo de regressão logística binária por meio de validação cruzada de dez vezes e avaliação do desempenho preditivo em conjuntos de validação interna e externa.b Estatísticas de validação cruzada do modelo de regressão LASSO para seleção de biomarcadores metabólicos.Os números dados acima representam o número médio de biomarcadores selecionados em um determinado λ.A linha pontilhada vermelha representa o valor médio de AUC no lambda correspondente.As barras de erro cinza representam os valores mínimo e máximo de AUC.A linha pontilhada indica o melhor modelo com os 27 biomarcadores selecionados.AUC, área sob a curva característica de operação do receptor (ROC).c Dobrar as alterações de 27 metabólitos selecionados no grupo LA em comparação com o grupo BN no grupo descoberta.Coluna vermelha – ativação.A coluna azul é um declínio.d – f Curvas de característica operacional do receptor (ROC) mostrando o poder do modelo discriminante baseado em 27 combinações de metabólitos nos conjuntos de descoberta, validação interna e externa.Os dados de origem são fornecidos na forma de arquivos de dados de origem.
Um modelo de predição foi criado com base nos coeficientes de regressão ponderados desses 27 metabólitos (Tabela Suplementar 3).A análise ROC baseada nestes 27 metabólitos produziu um valor de área sob a curva (AUC) de 0,933, a sensibilidade do grupo de descoberta foi de 0,868 e a especificidade foi de 0,859 (Fig. 2d).Enquanto isso, entre os 38 metabólitos diferenciais anotados entre LA e HC, um conjunto de 16 metabólitos alcançou uma AUC de 0,902 com sensibilidade de 0,801 e especificidade de 0,856 na discriminação de LA de HC (Figura 6a-c suplementar).Os valores de AUC baseados em diferentes limiares de alteração de dobra para metabólitos diferenciais também foram comparados.Descobrimos que o modelo de classificação teve melhor desempenho na discriminação entre LA e BN (HC) quando o nível de mudança de dobra foi definido como 1,2 versus 1,5 ou 2,0 (Figura 7a, b suplementar).O modelo de classificação, baseado em 27 grupos de metabólitos, foi posteriormente validado em coortes internas e externas.A AUC foi de 0,915 (sensibilidade 0,867, especificidade 0,811) para validação interna e 0,945 (sensibilidade 0,810, especificidade 0,979) para validação externa (Fig. 2e, f).Para avaliar a eficiência interlaboratorial, 40 amostras da coorte externa foram analisadas em laboratório externo conforme descrito na seção Métodos.A precisão da classificação atingiu uma AUC de 0,925 (Figura 8 suplementar).Como o carcinoma espinocelular do pulmão (LUSC) é o segundo subtipo mais comum de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) depois do adenocarcinoma pulmonar (LUAD), também testamos a utilidade potencial validada dos perfis metabólicos.BN e 16 casos de LUSC.A AUC de discriminação entre LUSC e BN foi de 0,776 (Figura 9 suplementar), indicando pior capacidade em comparação com a discriminação entre LUAD e BN.
Estudos demonstraram que o tamanho dos nódulos nas imagens de TC está positivamente correlacionado com a probabilidade de malignidade e continua sendo um importante determinante do tratamento dos nódulos25,26,27.A análise dos dados da grande coorte do estudo de triagem NELSON mostrou que o risco de malignidade em indivíduos com nódulos <5 mm foi até semelhante ao de indivíduos sem nódulos 28 .Portanto, o tamanho mínimo que requer monitoramento regular por TC é de 5 mm, conforme recomendado pela British Thoracic Society (BTS), e 6 mm, conforme recomendado pela Fleischner Society 29 .Entretanto, nódulos maiores que 6 mm e sem características benignas óbvias, chamados de nódulos pulmonares indeterminados (NPI), continuam sendo um grande desafio na avaliação e manejo na prática clínica30,31.Em seguida, examinamos se o tamanho do nódulo influenciava as assinaturas metabolômicas usando amostras agrupadas das coortes de descoberta e validação interna.Concentrando-nos em 27 biomarcadores validados, primeiro comparamos os perfis de PCA dos metabolomas sub-6 mm de HC e BN.Descobrimos que a maioria dos pontos de dados para HC e BN se sobrepuseram, demonstrando que os níveis séricos de metabólitos eram semelhantes em ambos os grupos (Fig. 3a).Os mapas de características em diferentes faixas de tamanho permaneceram conservados em BN e LA (Fig. 3b, c), enquanto foi observada uma separação entre nódulos malignos e benignos na faixa de 6 a 20 mm (Fig. 3d).Esta coorte apresentou AUC de 0,927, especificidade de 0,868 e sensibilidade de 0,820 para prever malignidade de nódulos medindo 6 a 20 mm (fig. 3e, f).Nossos resultados mostram que o classificador pode capturar alterações metabólicas causadas por transformação maligna precoce, independentemente do tamanho do nódulo.
ad Comparação de perfis de PCA entre grupos específicos com base em um classificador metabólico de 27 metabólitos.CC e BN < 6mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.em AE 6–20 mm versus AE 20–30 mm.g BN 6–20 mm e LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;AE 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Curva ROC (Receiver Operating Characteristic) mostrando desempenho do modelo discriminante para nódulos de 6–20 mm.f Os valores de probabilidade foram calculados com base no modelo de regressão logística para nódulos medindo 6–20 mm.A linha pontilhada cinza representa o valor de corte ideal (0,455).Os números acima representam a porcentagem de casos projetados para Los Angeles.Use um teste t de Student bicaudal.PCA, análise de componentes principais.Área AUC sob a curva.Os dados de origem são fornecidos na forma de arquivos de dados de origem.
Quatro amostras (com idades entre 44 e 61 anos) com tamanhos de nódulos pulmonares semelhantes (7 a 9 mm) foram selecionadas para ilustrar o desempenho do modelo de predição de malignidade proposto (Fig. 4a, b).Na triagem inicial, o Caso 1 apresentou-se como um nódulo sólido com calcificação, uma característica associada à benignidade, enquanto o Caso 2 apresentou-se como um nódulo parcialmente sólido indeterminado, sem características benignas óbvias.Três rodadas de tomografias computadorizadas de acompanhamento mostraram que esses casos permaneceram estáveis ao longo de um período de 4 anos e, portanto, foram considerados nódulos benignos (fig. 4a).Em comparação com a avaliação clínica de tomografias computadorizadas seriadas, a análise de metabólitos séricos de dose única com o modelo classificador atual identificou rápida e corretamente esses nódulos benignos com base em restrições probabilísticas (Tabela 1).A figura 4b do caso 3 mostra nódulo com sinais de retração pleural, mais frequentemente associado à malignidade32.O caso 4 apresentou-se como nódulo parcialmente sólido indeterminado, sem evidência de causa benigna.Todos esses casos foram previstos como malignos de acordo com o modelo classificador (Tabela 1).A avaliação do adenocarcinoma pulmonar foi demonstrada pelo exame histopatológico após cirurgia de ressecção pulmonar (fig. 4b).Para o conjunto de validação externa, o classificador metabólico previu com precisão dois casos de nódulos pulmonares indeterminados maiores que 6 mm (Figura 10 suplementar).
Imagens de tomografia computadorizada da janela axial dos pulmões de dois casos de nódulos benignos.No caso 1, a tomografia computadorizada após 4 anos mostrou nódulo sólido estável medindo 7 mm com calcificação no lobo inferior direito.No caso 2, a tomografia computadorizada após 5 anos revelou nódulo estável, parcialmente sólido, com diâmetro de 7 mm no lobo superior direito.b Imagens de TC em janela axial dos pulmões e estudos patológicos correspondentes de dois casos de adenocarcinoma em estágio I antes da ressecção pulmonar.O caso 3 revelou nódulo de 8 mm de diâmetro no lobo superior direito com retração pleural.O caso 4 revelou nódulo em vidro fosco parcialmente sólido medindo 9 mm no lobo superior esquerdo.Coloração com hematoxilina e eosina (H&E) do tecido pulmonar ressecado (barra de escala = 50 μm) demonstrando o padrão de crescimento acinar do adenocarcinoma pulmonar.As setas indicam nódulos detectados nas imagens de TC.As imagens H&E são imagens representativas de múltiplos (>3) campos microscópicos examinados pelo patologista.
Tomados em conjunto, nossos resultados demonstram o valor potencial dos biomarcadores metabólicos séricos no diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares, o que pode representar desafios na avaliação da triagem por TC.
Com base em um painel metabólico diferencial validado, procuramos identificar correlatos biológicos das principais alterações metabólicas.A análise de enriquecimento da via KEGG pelo MetaboAnalyst identificou 6 vias comuns significativamente alteradas entre os dois grupos determinados (LA vs. HC e LA vs. BN, p ajustado ≤ 0,001, efeito> 0,01).Essas alterações foram caracterizadas por distúrbios no metabolismo do piruvato, no metabolismo do triptofano, no metabolismo da niacina e da nicotinamida, na glicólise, no ciclo do TCA e no metabolismo das purinas (Fig. 5a).Em seguida, realizamos ainda a metabolômica direcionada para verificar as principais mudanças usando quantificação absoluta.Determinação de metabólitos comuns em vias comumente alteradas por espectrometria de massa triplo quadrupolo (QQQ) usando padrões de metabólitos autênticos.As características demográficas da amostra alvo do estudo metabolômico estão incluídas na Tabela Suplementar 4. Consistente com nossos resultados metabolômicos globais, a análise quantitativa confirmou que a hipoxantina e a xantina, o piruvato e o lactato estavam aumentados em LA em comparação com BN e HC (Fig. 5b, c, p<0,05).No entanto, não foram encontradas diferenças significativas nestes metabólitos entre BN e HC.
Análise de enriquecimento da via KEGG de metabólitos significativamente diferentes no grupo LA em comparação aos grupos BN e HC.Foi utilizado um Globaltest bicaudal e os valores de p foram ajustados pelo método de Holm-Bonferroni (p ajustado ≤ 0,001 e tamanho do efeito > 0,01).Gráficos b – d de violino mostrando os níveis de hipoxantina, xantina, lactato, piruvato e triptofano nos níveis séricos de HC, BN e LA determinados por LC-MS/MS (n = 70 por grupo).As linhas pontilhadas brancas e pretas indicam a mediana e o quartil, respectivamente.e Gráfico de violino mostrando expressão normalizada de mRNA Log2TPM (transcrições por milhão) de SLC7A5 e QPRT em adenocarcinoma de pulmão (n = 513) em comparação com tecido pulmonar normal (n = 59) no conjunto de dados LUAD-TCGA.A caixa branca representa o intervalo interquartil, a linha preta horizontal no centro representa a mediana e a linha preta vertical que se estende a partir da caixa representa o intervalo de confiança (IC) de 95%.f Gráfico de correlação de Pearson da expressão de SLC7A5 e GAPDH em adenocarcinoma de pulmão (n = 513) e tecido pulmonar normal (n = 59) no conjunto de dados TCGA.A área cinza representa o IC de 95%.r, coeficiente de correlação de Pearson.g Níveis celulares normalizados de triptofano em células A549 transfectadas com controle de shRNA inespecífico (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinados por LC-MS/MS.É apresentada a análise estatística de cinco amostras biologicamente independentes em cada grupo.h Níveis celulares de NADt (NAD total, incluindo NAD+ e NADH) em células A549 (NC) e células A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2).É apresentada a análise estatística de três amostras biologicamente independentes em cada grupo.i A atividade glicolítica das células A549 antes e depois do knockdown de SLC7A5 foi medida pela taxa de acidificação extracelular (ECAR) (n = 4 amostras biologicamente independentes por grupo).2-DG,2-desoxi-D-glicose.O teste t de Student bicaudal foi utilizado em (b – h).Em (g – i), as barras de erro representam a média ± DP, cada experimento foi realizado três vezes de forma independente e os resultados foram semelhantes.Os dados de origem são fornecidos na forma de arquivos de dados de origem.
Considerando o impacto significativo do metabolismo alterado do triptofano no grupo LA, também avaliamos os níveis séricos de triptofano nos grupos HC, BN e LA usando QQQ.Descobrimos que o triptofano sérico foi reduzido em LA em comparação com HC ou BN (p <0,001, Figura 5d), o que é consistente com achados anteriores de que os níveis circulantes de triptofano são mais baixos em pacientes com câncer de pulmão do que em controles saudáveis do grupo controle33,34 ,35.Outro estudo utilizando o traçador PET/CT 11C-metil-L-triptofano descobriu que o tempo de retenção do sinal de triptofano no tecido do câncer de pulmão foi significativamente aumentado em comparação com lesões benignas ou tecido normal36.Nossa hipótese é que a diminuição do triptofano no soro do AL pode refletir a captação ativa de triptofano pelas células do câncer de pulmão.
Sabe-se também que o produto final da via das quinureninas do catabolismo do triptofano é o NAD+37,38, que é um importante substrato para a reação do gliceraldeído-3-fosfato com o 1,3-bifosfoglicerato na glicólise39.Embora estudos anteriores tenham se concentrado no papel do catabolismo do triptofano na regulação imunológica, procuramos elucidar a interação entre a desregulação do triptofano e as vias glicolíticas observadas no presente estudo.O membro 5 da família de transportadores de solutos 7 (SLC7A5) é conhecido por ser um transportador de triptofano .A fosforibosiltransferase do ácido quinolínico (QPRT) é uma enzima localizada a jusante da via da quinurenina que converte o ácido quinolínico em NAMN46.A inspeção do conjunto de dados LUAD TCGA revelou que tanto o SLC7A5 quanto o QPRT foram significativamente regulados positivamente no tecido tumoral em comparação com o tecido normal (Fig. 5e).Este aumento foi observado nos estágios I e II, bem como nos estágios III e IV do adenocarcinoma pulmonar (Figura 11 suplementar), indicando distúrbios precoces no metabolismo do triptofano associados à tumorigênese.
Além disso, o conjunto de dados LUAD-TCGA mostrou uma correlação positiva entre a expressão de mRNA de SLC7A5 e GAPDH em amostras de pacientes com câncer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f).Em contraste, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre essas assinaturas genéticas no tecido pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f).O knockdown de SLC7A5 (Figura 12 suplementar) em células A549 reduziu significativamente os níveis celulares de triptofano e NAD (H) (Figura 5g, h), resultando em atividade glicolítica atenuada conforme medido pela taxa de acidificação extracelular (ECAR) (Figura 1).5i).Assim, com base nas alterações metabólicas na detecção sérica e in vitro, levantamos a hipótese de que o metabolismo do triptofano pode produzir NAD+ através da via da quinurenina e desempenhar um papel importante na promoção da glicólise no câncer de pulmão.
Estudos demonstraram que um grande número de nódulos pulmonares indeterminados detectados por TCBD podem levar à necessidade de exames adicionais, como PET-TC, biópsia pulmonar e tratamento excessivo devido a um diagnóstico falso-positivo de malignidade.31 Conforme mostrado na Figura 6, nosso estudo identificou um painel de metabólitos séricos com potencial valor diagnóstico que pode melhorar a estratificação de risco e subsequente manejo de nódulos pulmonares detectados por TC.
Os nódulos pulmonares são avaliados por meio de tomografia computadorizada de baixa dose (TCLD) com características de imagem sugestivas de causas benignas ou malignas.O resultado incerto dos nódulos pode levar a consultas de acompanhamento frequentes, intervenções desnecessárias e tratamento excessivo.A inclusão de classificadores metabólicos séricos com valor diagnóstico pode melhorar a avaliação de risco e posterior manejo de nódulos pulmonares.Tomografia por emissão de pósitrons PET.
Dados do estudo NLST dos EUA e do estudo europeu NELSON sugerem que o rastreio de grupos de alto risco com tomografia computorizada de baixa dose (LDCT) pode reduzir a mortalidade por cancro do pulmão1,3.No entanto, a avaliação do risco e o subsequente manejo clínico de um grande número de nódulos pulmonares incidentais detectados pela TCBD continuam sendo os mais desafiadores.O principal objetivo é otimizar a classificação correta dos protocolos existentes baseados em LDCT, incorporando biomarcadores confiáveis.
Certos biomarcadores moleculares, como metabólitos sanguíneos, foram identificados comparando o câncer de pulmão com controles saudáveis15,17.No presente estudo, focamos na aplicação da análise metabolômica sérica para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos detectados incidentalmente pela TCBD.Comparamos o metaboloma sérico global de amostras de controle saudável (HC), nódulos pulmonares benignos (BN) e adenocarcinoma pulmonar em estágio I (LA) usando análise UPLC-HRMS.Descobrimos que HC e BN apresentaram perfis metabólicos semelhantes, enquanto LA apresentou alterações significativas em comparação com HC e BN.Identificamos dois conjuntos de metabólitos séricos que diferenciam LA de HC e BN.
O atual esquema de identificação baseado em LDCT para nódulos benignos e malignos baseia-se principalmente no tamanho, densidade, morfologia e taxa de crescimento dos nódulos ao longo do tempo30.Estudos anteriores demonstraram que o tamanho dos nódulos está intimamente relacionado com a probabilidade de cancro do pulmão.Mesmo em pacientes de alto risco, o risco de malignidade em linfonodos <6 mm é <1%.O risco de malignidade para nódulos medindo 6 a 20 mm varia de 8% a 64%30.Portanto, a Sociedade Fleischner recomenda um diâmetro de corte de 6 mm para acompanhamento rotineiro por TC.29 Entretanto, a avaliação de risco e o manejo de nódulos pulmonares indeterminados (NPI) maiores que 6 mm não têm sido realizados adequadamente 31 .O manejo atual da doença cardíaca congênita geralmente é baseado na espera vigilante com monitoramento frequente por TC.
Com base no metaboloma validado, demonstramos pela primeira vez a sobreposição de assinaturas metabolômicas entre indivíduos saudáveis e nódulos benignos <6 mm.A semelhança biológica é consistente com achados anteriores de TC de que o risco de malignidade para nódulos <6 mm é tão baixo quanto para indivíduos sem nódulos.30 Deve-se notar que nossos resultados também demonstram que nódulos benignos <6 mm e ≥6 mm têm alta semelhança nos perfis metabolômicos, sugerindo que a definição funcional de etiologia benigna é consistente, independentemente do tamanho do nódulo.Assim, os modernos painéis diagnósticos de metabólitos séricos podem fornecer um único ensaio como teste de exclusão quando nódulos são inicialmente detectados na TC e potencialmente reduzir o monitoramento em série.Ao mesmo tempo, o mesmo painel de biomarcadores metabólicos distinguiu nódulos malignos ≥6 mm de tamanho de nódulos benignos e forneceu previsões precisas para NPIs de tamanho semelhante e características morfológicas ambíguas em imagens de TC.Este classificador do metabolismo sérico teve um bom desempenho na previsão da malignidade de nódulos ≥6 mm com uma AUC de 0,927.Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que assinaturas metabolômicas séricas únicas podem refletir especificamente alterações metabólicas precoces induzidas por tumor e ter valor potencial como preditores de risco, independentemente do tamanho do nódulo.
Notavelmente, o adenocarcinoma de pulmão (LUAD) e o carcinoma de células escamosas (LUSC) são os principais tipos de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).Dado que o LUSC está fortemente associado ao uso de tabaco47 e o LUAD é a histologia mais comum de nódulos pulmonares incidentais detectados na triagem por TC48, nosso modelo classificador foi construído especificamente para amostras de adenocarcinoma em estágio I.Wang e colegas também se concentraram no LUAD e identificaram nove assinaturas lipídicas usando a lipidômica para distinguir o câncer de pulmão em estágio inicial de indivíduos saudáveis17.Testamos o modelo classificador atual em 16 casos de LUSC em estágio I e 74 nódulos benignos e observamos baixa precisão de predição de LUSC (AUC 0,776), sugerindo que LUAD e LUSC podem ter suas próprias assinaturas metabolômicas.Na verdade, foi demonstrado que LUAD e LUSC diferem em etiologia, origem biológica e aberrações genéticas .Portanto, outros tipos de histologia devem ser incluídos em modelos de treinamento para detecção populacional de câncer de pulmão em programas de rastreamento.
Aqui, identificamos as seis vias mais frequentemente alteradas no adenocarcinoma pulmonar em comparação com controles saudáveis e nódulos benignos.Xantina e hipoxantina são metabólitos comuns da via metabólica das purinas.Consistente com nossos resultados, os intermediários associados ao metabolismo das purinas estavam significativamente aumentados no soro ou nos tecidos de pacientes com adenocarcinoma pulmonar em comparação com controles saudáveis ou pacientes no estágio pré-invasivo15,50.Níveis séricos elevados de xantina e hipoxantina podem refletir o anabolismo exigido pelas células cancerígenas em rápida proliferação.A desregulação do metabolismo da glicose é uma marca bem conhecida do metabolismo do câncer51.Aqui observamos um aumento significativo de piruvato e lactato no grupo LA em comparação com o grupo HC e BN o que é consistente com relatos anteriores de anormalidades da via glicolítica nos perfis do metaboloma sérico de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e controles saudáveis.os resultados são consistentes52,53.
É importante ressaltar que observamos uma correlação inversa entre o metabolismo do piruvato e do triptofano no soro dos adenocarcinomas pulmonares.Os níveis séricos de triptofano foram reduzidos no grupo LA em comparação com o grupo HC ou BN.Curiosamente, um estudo anterior em grande escala utilizando uma coorte prospectiva descobriu que baixos níveis de triptofano circulante estavam associados a um risco aumentado de cancro do pulmão 54 .O triptofano é um aminoácido essencial que obtemos inteiramente dos alimentos.Concluímos que a depleção sérica de triptofano no adenocarcinoma pulmonar pode refletir a rápida depleção desse metabólito.É bem conhecido que o produto final do catabolismo do triptofano através da via da quinurenina é a fonte da síntese de novo de NAD+.Como o NAD+ é produzido principalmente através da via de resgate, a importância do NAD+ no metabolismo do triptofano na saúde e na doença continua por determinar46.Nossa análise do banco de dados TCGA mostrou que a expressão do transportador de soluto transportador de triptofano 7A5 (SLC7A5) foi significativamente aumentada no adenocarcinoma pulmonar em comparação com controles normais e foi positivamente correlacionada com a expressão da enzima glicolítica GAPDH.Estudos anteriores concentraram-se principalmente no papel do catabolismo do triptofano na supressão da resposta imune antitumoral40,41,42.Aqui demonstramos que a inibição da captação de triptofano por knockdown de SLC7A5 em células de câncer de pulmão resulta em uma diminuição subsequente nos níveis celulares de NAD e em uma atenuação concomitante da atividade glicolítica.Em resumo, nosso estudo fornece uma base biológica para alterações no metabolismo sérico associadas à transformação maligna do adenocarcinoma pulmonar.
Mutações de EGFR são as mutações condutoras mais comuns em pacientes com NSCLC.Em nosso estudo, descobrimos que pacientes com mutação de EGFR (n = 41) apresentavam perfis metabolômicos gerais semelhantes aos pacientes com EGFR de tipo selvagem (n = 31), embora tenhamos encontrado níveis séricos diminuídos de alguns pacientes com mutação de EGFR em pacientes com acilcarnitina.A função estabelecida das acilcarnitinas é transportar grupos acil do citoplasma para a matriz mitocondrial, levando à oxidação de ácidos graxos para produzir energia 55 .Consistente com nossas descobertas, um estudo recente também identificou perfis de metaboloma semelhantes entre tumores mutantes de EGFR e tumores de tipo selvagem de EGFR, analisando o metaboloma global de 102 amostras de tecido de adenocarcinoma pulmonar .Curiosamente, o conteúdo de acilcarnitina também foi encontrado no grupo mutante de EGFR.Portanto, se as alterações nos níveis de acilcarnitina refletem as alterações metabólicas induzidas pelo EGFR e as vias moleculares subjacentes podem merecer um estudo mais aprofundado.
Concluindo, nosso estudo estabelece um classificador metabólico sérico para o diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares e propõe um fluxo de trabalho que pode otimizar a avaliação de risco e facilitar o manejo clínico baseado na triagem por tomografia computadorizada.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital do Câncer da Universidade Sun Yat-sen, pelo Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen e pelo Comitê de Ética do Hospital do Câncer da Universidade de Zhengzhou.Nos grupos de descoberta e validação interna, 174 soros de indivíduos saudáveis e 244 soros de nódulos benignos foram coletados de indivíduos submetidos a exames médicos anuais no Departamento de Controle e Prevenção do Câncer, Centro de Câncer da Universidade Sun Yat-sen, e 166 nódulos benignos.sérum.Os adenocarcinomas pulmonares em estágio I foram coletados no Sun Yat-sen University Cancer Center.Na coorte de validação externa, houve 48 casos de nódulos benignos, 39 casos de adenocarcinoma pulmonar em estágio I do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen e 24 casos de adenocarcinoma pulmonar em estágio I do Hospital de Câncer de Zhengzhou.O Centro de Câncer da Universidade Sun Yat-sen também coletou 16 casos de câncer de pulmão de células escamosas em estágio I para testar a capacidade diagnóstica do classificador metabólico estabelecido (as características do paciente são mostradas na Tabela Suplementar 5).As amostras da coorte de descoberta e da coorte de validação interna foram coletadas entre janeiro de 2018 e maio de 2020. As amostras da coorte de validação externa foram coletadas entre agosto de 2021 e outubro de 2022. Para minimizar o preconceito de gênero, números aproximadamente iguais de casos masculinos e femininos foram atribuídos a cada um. coorte.Equipe de descoberta e equipe de revisão interna.O gênero do participante foi determinado com base no autorrelato.O consentimento informado foi obtido de todos os participantes e nenhuma compensação foi fornecida.Os indivíduos com nódulos benignos foram aqueles com pontuação estável na tomografia computadorizada entre 2 e 5 anos no momento da análise, exceto 1 caso da amostra de validação externa, que foi coletada no pré-operatório e diagnosticada por histopatologia.Com exceção da bronquite crônica.Os casos de adenocarcinoma pulmonar foram coletados antes da ressecção pulmonar e confirmados pelo diagnóstico anatomopatológico.Amostras de sangue em jejum foram coletadas em tubos de separação de soro sem anticoagulantes.As amostras de sangue foram coaguladas durante 1 hora à temperatura ambiente e depois centrifugadas a 2851 x g durante 10 minutos a 4°C para recolher o sobrenadante do soro.Alíquotas de soro foram congeladas a -80°C até a extração do metabólito.O Departamento de Prevenção do Câncer e Exame Médico do Centro de Câncer da Universidade Sun Yat-sen coletou um conjunto de soro de 100 doadores saudáveis, incluindo um número igual de homens e mulheres com idades entre 40 e 55 anos.Volumes iguais de cada amostra do doador foram misturados, o conjunto resultante foi dividido em alíquotas e armazenado a -80°C.A mistura de soros foi utilizada como material de referência para controle de qualidade e padronização dos dados.
O soro de referência e as amostras de teste foram descongelados e os metabólitos foram extraídos usando um método de extração combinado (MTBE/metanol/água) 56 .Resumidamente, 50 μl de soro foram misturados com 225 μl de metanol gelado e 750 μl de éter metil terc-butílico gelado (MTBE).Mexa a mistura e incube em gelo por 1 hora.As amostras foram então misturadas e misturadas em vórtex com 188 μl de água de grau MS contendo padrões internos (13C-lactato, 13C3-piruvato, 13C-metionina e 13C6-isoleucina, adquiridos da Cambridge Isotope Laboratories).A mistura foi então centrifugada a 15.000 × g por 10 min a 4 ° C, e a fase inferior foi transferida para dois tubos (125 μL cada) para análise por LC-MS nos modos positivo e negativo.Finalmente, a amostra foi evaporada até à secura num concentrador de vácuo de alta velocidade.
Os metabólitos secos foram reconstituídos em 120 μl de acetonitrila a 80%, agitados em vórtex por 5 min e centrifugados a 15.000 × g por 10 min a 4 ° C.Os sobrenadantes foram transferidos para frascos de vidro âmbar com microinserções para estudos metabolômicos.Análise metabolômica não direcionada em uma plataforma de cromatografia líquida de ultra-desempenho e espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS).Os metabólitos foram separados usando um sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC e uma coluna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).No modo de íon positivo, as fases móveis eram 95% (A) e 50% de acetonitrila (B), cada uma contendo 10 mmol/L de acetato de amônio e 0,1% de ácido fórmico.No modo negativo, as fases móveis A e B continham 95% e 50% de acetonitrila, respectivamente, ambas as fases continham 10 mmol/L de acetato de amônio, pH = 9. O programa de gradiente foi o seguinte: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16,1.min, 98-2% B;16,1–20 min, 2% B. A coluna foi mantida a 40°C e a amostra a 10°C no amostrador automático.A vazão foi de 0,3 ml/min, o volume de injeção foi de 3 μl.Um espectrômetro de massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) foi operado em modo de varredura completa e acoplado ao modo de monitoramento ddMS2 para coletar grandes volumes de dados.Os parâmetros MS foram definidos da seguinte forma: tensão de pulverização +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capilar 320°C, gás de proteção 40 arb, gás auxiliar 10 arb, temperatura do aquecedor da sonda 350°C, faixa de varredura 70–1050 m/ h, resolução.70.000. Os dados foram adquiridos usando Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Para avaliar a qualidade dos dados, amostras agrupadas de controle de qualidade (CQ) foram geradas removendo alíquotas de 10 μL do sobrenadante de cada amostra.Seis injeções de amostras de controle de qualidade foram analisadas no início da sequência analítica para avaliar a estabilidade do sistema UPLC-MS.Amostras de controle de qualidade são então introduzidas periodicamente no lote.Todos os 11 lotes de amostras de soro neste estudo foram analisados por LC-MS.Alíquotas de uma mistura de soro de 100 doadores saudáveis foram utilizadas como material de referência nos respectivos lotes para monitorar o processo de extração e ajustar os efeitos lote a lote.A análise metabolômica não direcionada da coorte de descoberta, coorte de validação interna e coorte de validação externa foi realizada no Centro de Metabolômica da Universidade Sun Yat-sen.O laboratório externo do Centro de Análise e Testes da Universidade de Tecnologia de Guangdong também analisou 40 amostras da coorte externa para testar o desempenho do modelo classificador.
Após extração e reconstituição, a quantificação absoluta dos metabólitos séricos foi medida usando espectrometria de massa em tandem com cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (triplo quadrupolo Agilent 6495) com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo de monitoramento de reação múltipla (MRM).Uma coluna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) foi usada para separar metabólitos.A fase móvel consistiu de 90% (A) e 5% de acetonitrila (B) com 10 mmol/L de acetato de amônio e solução de amônia 0,1%.O programa de gradiente foi o seguinte: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.A coluna foi mantida a 40°C e a amostra a 10°C no amostrador automático.A vazão foi de 0,3 mL/min e o volume de injeção foi de 1 μL.Os parâmetros MS foram definidos da seguinte forma: tensão capilar ±3,5 kV, pressão do nebulizador 35 psi, fluxo de gás de bainha 12 L/min, temperatura do gás de bainha 350°C, temperatura do gás de secagem 250°C e fluxo de gás de secagem 14 l/min.As conversões MRM de triptofano, piruvato, lactato, hipoxantina e xantina foram 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 e 151,0–107.9 respectivamente.Os dados foram coletados usando Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Para amostras de soro, triptofano, piruvato, lactato, hipoxantina e xantina foram quantificados utilizando curvas de calibração de soluções de mistura padrão.Para amostras de células, o conteúdo de triptofano foi normalizado para o padrão interno e a massa proteica celular.
A extração de pico (m/z e tempo de retenção (RT)) foi realizada usando Compound Discovery 3.1 e TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Para eliminar diferenças potenciais entre lotes, cada pico característico da amostra de teste foi dividido pelo pico característico do material de referência do mesmo lote para obter a abundância relativa.Os desvios padrão relativos dos padrões internos antes e depois da padronização são mostrados na Tabela Suplementar 6. As diferenças entre os dois grupos foram caracterizadas por taxa de descoberta falsa (FDR <0,05, teste de classificação sinalizada de Wilcoxon) e mudança de dobra (> 1,2 ou <0,83).Os dados brutos de MS das características extraídas e os dados de referência de MS corrigidos pelo soro são mostrados em Dados Suplementares 1 e Dados Suplementares 2, respectivamente.A anotação de pico foi realizada com base em quatro níveis definidos de identificação, incluindo metabólitos identificados, compostos supostamente anotados, classes de compostos supostamente caracterizadas e compostos desconhecidos 22 .Com base em pesquisas de banco de dados no Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), compostos biológicos com padrões validados correspondentes a MS/MS ou anotações de correspondência exata em mzCloud (pontuação> 85) ou Chemspider foram finalmente selecionados como intermediários entre o metaboloma diferencial.As anotações de pico para cada característica estão incluídas nos Dados Suplementares 3. O MetaboAnalyst 5.0 foi usado para análise univariada da abundância de metabólitos normalizada pela soma.O MetaboAnalyst 5.0 também avaliou a análise de enriquecimento da via KEGG com base em metabólitos significativamente diferentes.A análise de componentes principais (PCA) e a análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foram analisadas usando o pacote de software ropls (v.1.26.4) com normalização de pilha e escalonamento automático.O modelo ideal de biomarcador metabólico para prever a malignidade do nódulo foi gerado usando regressão logística binária com menor encolhimento absoluto e operador de seleção (LASSO, pacote R v.4.1-3).O desempenho do modelo discriminante nos conjuntos de detecção e validação foi caracterizado pela estimativa da AUC com base na análise ROC de acordo com o pacote pROC (v.1.18.0.).O ponto de corte ótimo de probabilidade foi obtido com base no índice de Youden máximo do modelo (sensibilidade + especificidade – 1).Amostras com valores menores ou maiores que o limiar serão previstas como nódulos benignos e adenocarcinoma pulmonar, respectivamente.
Células A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) foram cultivadas em meio F-12K contendo 10% de FBS.Sequências curtas de RNA em gancho (shRNA) direcionadas a SLC7A5 e um controle não direcionado (NC) foram inseridas no vetor lentiviral pLKO.1-puro.As sequências antisense de shSLC7A5 são as seguintes: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3 '), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Anticorpos para SLC7A5 (#5347) e tubulina (#2148) foram adquiridos da Cell Signaling Technology.Anticorpos para SLC7A5 e tubulina foram utilizados numa diluição de 1:1000 para análise de Western blot.
O teste de estresse glicolítico Seahorse XF mede os níveis de acidificação extracelular (ECAR).No ensaio, glicose, oligomicina A e 2-DG foram administradas sequencialmente para testar a capacidade glicolítica celular medida por ECAR.
Células A549 transfectadas com controle não direcionado (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) foram plaqueadas durante a noite em placas de 10 cm de diâmetro.Os metabólitos celulares foram extraídos com 1 ml de metanol aquoso a 80% gelado.As células na solução de metanol foram raspadas, coletadas em um novo tubo e centrifugadas a 15.000 x g por 15 min a 4°C.Recolher 800 ul de sobrenadante e secar utilizando um concentrador de vácuo de alta velocidade.Os pellets de metabólitos secos foram então analisados quanto aos níveis de triptofano usando LC-MS/MS como descrito acima.Os níveis celulares de NAD(H) em células A549 (NC e shSLC7A5) foram medidos utilizando um kit colorimétrico quantitativo NAD+/NADH (#K337, BioVision) de acordo com as instruções do fabricante.Os níveis de proteína foram medidos para cada amostra para normalizar a quantidade de metabólitos.
Nenhum método estatístico foi utilizado para determinar preliminarmente o tamanho da amostra.Estudos metabolômicos anteriores visando a descoberta de biomarcadores15,18 foram considerados referências para determinação de tamanho e, em comparação com esses relatórios, nossa amostra foi adequada.Nenhuma amostra foi excluída da coorte do estudo.As amostras de soro foram designadas aleatoriamente para um grupo de descoberta (306 casos, 74,6%) e um grupo de validação interna (104 casos, 25,4%) para estudos metabolômicos não direcionados.Também selecionamos aleatoriamente 70 casos de cada grupo do conjunto de descobertas para estudos metabolômicos direcionados.Os investigadores não tinham conhecimento da atribuição de grupo durante a coleta e análise de dados por LC-MS.Análises estatísticas de dados metabolômicos e experimentos celulares são descritas nas respectivas seções Resultados, Legendas de Figuras e Métodos.A quantificação do triptofano celular, NADT e atividade glicolítica foi realizada três vezes de forma independente, com resultados idênticos.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o Resumo do Relatório do Portfólio Natural associado a este artigo.
Os dados brutos de MS das características extraídas e os dados normalizados de MS do soro de referência são mostrados em Dados Suplementares 1 e Dados Suplementares 2, respectivamente.Anotações de pico para características diferenciais são apresentadas em Dados Suplementares 3. O conjunto de dados LUAD TCGA pode ser baixado de https://portal.gdc.cancer.gov/.Os dados de entrada para traçar o gráfico são fornecidos nos dados de origem.Os dados de origem são fornecidos para este artigo.
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Horário da postagem: 18 de setembro de 2023