O diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares identificados por tomografia computadorizada (TC) continua sendo um desafio na prática clínica. Neste estudo, caracterizamos o metaboloma global de 480 amostras de soro, incluindo controles saudáveis, nódulos pulmonares benignos e adenocarcinoma de pulmão em estágio I. Os adenocarcinomas exibem perfis metabolômicos únicos, enquanto nódulos benignos e indivíduos saudáveis apresentam alta similaridade nesses perfis. No grupo de descoberta (n = 306), um conjunto de 27 metabólitos foi identificado para diferenciar nódulos benignos de malignos. A AUC do modelo discriminante nos grupos de validação interna (n = 104) e externa (n = 111) foi de 0,915 e 0,945, respectivamente. A análise de vias metabólicas revelou um aumento de metabólitos glicolíticos associado à diminuição do triptofano no soro de pacientes com adenocarcinoma de pulmão em comparação com nódulos benignos e controles saudáveis, sugerindo que a captação de triptofano promove a glicólise em células de câncer de pulmão. Nosso estudo destaca o valor dos biomarcadores de metabólitos séricos na avaliação do risco de nódulos pulmonares detectados por tomografia computadorizada.
O diagnóstico precoce é crucial para melhorar as taxas de sobrevida de pacientes com câncer. Resultados do Estudo Nacional de Rastreamento de Câncer de Pulmão dos EUA (NLST) e do Estudo Europeu NELSON demonstraram que o rastreamento com tomografia computadorizada de baixa dose (TCBD) pode reduzir significativamente a mortalidade por câncer de pulmão em grupos de alto risco1,2,3. Desde a ampla utilização da TCBD para rastreamento de câncer de pulmão, a incidência de achados radiográficos incidentais de nódulos pulmonares assintomáticos tem aumentado continuamente4. Nódulos pulmonares são definidos como opacidades focais de até 3 cm de diâmetro5. Enfrentamos dificuldades na avaliação da probabilidade de malignidade e no tratamento do grande número de nódulos pulmonares detectados incidentalmente em exames de TCBD. As limitações da tomografia computadorizada podem levar a exames de acompanhamento frequentes e resultados falso-positivos, resultando em intervenções desnecessárias e sobretratamento6. Portanto, há necessidade de desenvolver biomarcadores confiáveis e úteis para identificar corretamente o câncer de pulmão em estágios iniciais e diferenciar a maioria dos nódulos benignos na detecção inicial7.
A análise molecular abrangente do sangue (soro, plasma, células mononucleares do sangue periférico), incluindo genômica, proteômica ou metilação do DNA8,9,10, tem levado a um crescente interesse na descoberta de biomarcadores diagnósticos para o câncer de pulmão. Enquanto isso, as abordagens metabolômicas medem produtos finais celulares que são influenciados por ações endógenas e exógenas e, portanto, são aplicadas para prever o início e o desfecho da doença. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) é um método amplamente utilizado para estudos metabolômicos devido à sua alta sensibilidade e grande faixa dinâmica, que pode abranger metabólitos com diferentes propriedades físico-químicas11,12,13. Embora a análise metabolômica global do plasma/soro tenha sido usada para identificar biomarcadores associados ao diagnóstico de câncer de pulmão14,15,16,17 e à eficácia do tratamento18, os classificadores de metabólitos séricos para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos ainda precisam ser amplamente estudados.
O adenocarcinoma e o carcinoma de células escamosas são os dois principais subtipos de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC). Vários exames de triagem por tomografia computadorizada (TC) indicam que o adenocarcinoma é o tipo histológico mais comum de câncer de pulmão1,19,20,21. Neste estudo, utilizamos cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (UPLC-HRMS) para realizar uma análise metabolômica em um total de 695 amostras de soro, incluindo controles saudáveis, nódulos pulmonares benignos e nódulos ≤3 cm detectados por TC, para triagem de adenocarcinoma de pulmão em estágio I. Identificamos um conjunto de metabólitos séricos que distinguem o adenocarcinoma de pulmão de nódulos benignos e controles saudáveis. A análise de enriquecimento de vias metabólicas revelou que alterações no metabolismo anormal de triptofano e glicose são comuns no adenocarcinoma de pulmão em comparação com nódulos benignos e controles saudáveis. Finalmente, estabelecemos e validamos um classificador metabólico sérico com alta especificidade e sensibilidade para distinguir entre nódulos pulmonares malignos e benignos detectados por TC de baixa dose, o que pode auxiliar no diagnóstico diferencial precoce e na avaliação de risco.
No presente estudo, amostras de soro pareadas por sexo e idade foram coletadas retrospectivamente de 174 controles saudáveis, 292 pacientes com nódulos pulmonares benignos e 229 pacientes com adenocarcinoma de pulmão em estágio I. As características demográficas dos 695 participantes são apresentadas na Tabela Suplementar 1.
Conforme mostrado na Figura 1a, um total de 480 amostras de soro, incluindo 174 controles saudáveis (CS), 170 nódulos benignos (NB) e 136 amostras de adenocarcinoma de pulmão em estágio I (AP), foram coletadas no Centro de Câncer da Universidade Sun Yat-sen. A coorte de descoberta foi utilizada para o perfilamento metabolômico não direcionado por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (UPLC-HRMS). Como mostrado na Figura Suplementar 1, metabólitos diferenciais entre AP e CS, e entre AP e NB, foram identificados para estabelecer um modelo de classificação e explorar ainda mais a análise de vias metabólicas diferenciais. Cento e quatro amostras coletadas pelo Centro de Câncer da Universidade Sun Yat-sen e 111 amostras coletadas por outros dois hospitais foram submetidas à validação interna e externa, respectivamente.
a População do estudo na coorte de descoberta submetida à análise metabolômica global do soro utilizando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (UPLC-HRMS). b Análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) do metaboloma total de 480 amostras de soro da coorte do estudo, incluindo controles saudáveis (CS, n = 174), nódulos benignos (NB, n = 170) e adenocarcinoma de pulmão em estágio I (Los Angeles, n = 136). +ESI, modo de ionização por eletrospray positivo; -ESI, modo de ionização por eletrospray negativo. c–e Metabólitos com abundâncias significativamente diferentes em dois grupos específicos (teste de Wilcoxon com duas caudas, valor p ajustado pela taxa de descoberta falsa, FDR < 0,05) são mostrados em vermelho (variação > 1,2 vezes) e azul (variação < 0,83 vezes). ) mostrado no gráfico de vulcão. f Mapa de calor de agrupamento hierárquico mostrando diferenças significativas no número de metabólitos anotados entre LA e BN. Os dados de origem são fornecidos na forma de arquivos de dados de origem.
O metaboloma sérico total de 174 indivíduos do grupo controle (HC), 170 do grupo de controle negativo (BN) e 136 do grupo de diagnóstico (LA) foi analisado por UPLC-HRMS. Demonstramos inicialmente que as amostras de controle de qualidade (CQ) se agrupam de forma coesa no centro de um modelo de análise de componentes principais (PCA) não supervisionado, confirmando a estabilidade do desempenho do presente estudo (Figura Suplementar 2).
Conforme demonstrado na análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) na Figura 1b, observamos diferenças claras entre LA e BN, e entre LA e HC, nos modos de ionização por eletrospray positivo (+ESI) e negativo (−ESI). No entanto, não foram encontradas diferenças significativas entre BN e HC nas condições +ESI e -ESI.
Encontramos 382 características diferenciais entre LA e HC, 231 características diferenciais entre LA e BN e 95 características diferenciais entre BN e HC (teste de Wilcoxon com sinais ordenados, FDR <0,05 e mudança múltipla >1,2 ou <0,83) (Figura 1c-e). Os picos foram posteriormente anotados (Dados Suplementares 3) em relação a um banco de dados (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) por valor m/z, tempo de retenção e busca por espectro de massa de fragmentação (detalhes descritos na seção Métodos)22. Finalmente, 33 e 38 metabólitos anotados com diferenças significativas na abundância foram identificados para LA versus BN (Figura 1f e Tabela Suplementar 2) e LA versus HC (Figura Suplementar 3 e Tabela Suplementar 2), respectivamente. Em contraste, apenas 3 metabólitos com diferenças significativas na abundância foram identificados em BN e HC (Tabela Suplementar 2), o que é consistente com a sobreposição entre BN e HC na PLS-DA. Esses metabólitos diferenciais abrangem uma ampla gama de substâncias bioquímicas (Figura Suplementar 4). Em conjunto, esses resultados demonstram alterações significativas no metaboloma sérico que refletem a transformação maligna do câncer de pulmão em estágio inicial, em comparação com nódulos pulmonares benignos ou indivíduos saudáveis. Enquanto isso, a similaridade do metaboloma sérico de nódulos pulmonares benignos (NPB) e controles saudáveis (CS) sugere que nódulos pulmonares benignos podem compartilhar muitas características biológicas com indivíduos saudáveis. Dado que mutações no gene do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) são comuns no adenocarcinoma de pulmão subtipo 23, buscamos determinar o impacto de mutações condutoras no metaboloma sérico. Em seguida, analisamos o perfil metabolômico geral de 72 casos com status de EGFR no grupo de adenocarcinoma de pulmão. Curiosamente, encontramos perfis comparáveis entre pacientes com mutação no EGFR (n = 41) e pacientes com EGFR selvagem (n = 31) na análise de componentes principais (ACP) (Figura Suplementar 5a). No entanto, identificamos 7 metabólitos cuja abundância foi significativamente alterada em pacientes com mutação no EGFR em comparação com pacientes com EGFR do tipo selvagem (teste t, p < 0,05 e variação > 1,2 ou < 0,83) (Figura Suplementar 5b). A maioria desses metabólitos (5 de 7) são acilcarnitinas, que desempenham um papel importante nas vias de oxidação de ácidos graxos.
Conforme ilustrado no fluxo de trabalho mostrado na Figura 2a, os biomarcadores para classificação de nódulos foram obtidos utilizando operadores de redução absoluta mínima (LASSO) e seleção baseada em 33 metabólitos diferenciais identificados em LA (n = 136) e BN (n = 170). A melhor combinação de variáveis (LASSO) foi utilizada como modelo de regressão logística binária. A validação cruzada de dez vezes foi usada para testar a confiabilidade do modelo. A seleção de variáveis e a regularização de parâmetros foram ajustadas por uma penalidade de maximização da verossimilhança com parâmetro λ24. Uma análise metabolômica global foi realizada independentemente nos grupos de validação interna (n = 104) e externa (n = 111) para testar o desempenho de classificação do modelo discriminante. Como resultado, 27 metabólitos no conjunto de descoberta foram identificados como o melhor modelo discriminante com o maior valor médio de AUC (Figura 2b), entre os quais 9 apresentaram atividade aumentada e 18 atividade diminuída em LA em comparação com BN (Figura 2c).
Fluxograma para a construção de um classificador de nódulos pulmonares, incluindo a seleção do melhor painel de metabólitos séricos no conjunto de descoberta usando um modelo de regressão logística binária por meio de validação cruzada de dez vezes e a avaliação do desempenho preditivo em conjuntos de validação interna e externa. b Estatísticas de validação cruzada do modelo de regressão LASSO para seleção de biomarcadores metabólicos. Os números acima representam o número médio de biomarcadores selecionados em um determinado λ. A linha pontilhada vermelha representa o valor médio da AUC no lambda correspondente. As barras de erro cinza representam os valores mínimo e máximo da AUC. A linha pontilhada indica o melhor modelo com os 27 biomarcadores selecionados. AUC, área sob a curva ROC (Receiver Operating Characteristic). c Alterações relativas de 27 metabólitos selecionados no grupo LA em comparação com o grupo BN no grupo de descoberta. Coluna vermelha – ativação. A coluna azul representa um declínio. d–f Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) mostrando o poder do modelo discriminante baseado em 27 combinações de metabólitos nos conjuntos de descoberta, validação interna e validação externa. Os dados de origem são fornecidos na forma de arquivos de dados de origem.
Um modelo de predição foi criado com base nos coeficientes de regressão ponderados desses 27 metabólitos (Tabela Suplementar 3). A análise ROC baseada nesses 27 metabólitos apresentou um valor de área sob a curva (AUC) de 0,933, sensibilidade do grupo de descoberta de 0,868 e especificidade de 0,859 (Figura 2d). Enquanto isso, entre os 38 metabólitos diferenciais anotados entre LA e HC, um conjunto de 16 metabólitos alcançou uma AUC de 0,902 com sensibilidade de 0,801 e especificidade de 0,856 na discriminação entre LA e HC (Figura Suplementar 6a-c). Os valores de AUC baseados em diferentes limiares de variação relativa para metabólitos diferenciais também foram comparados. Descobrimos que o modelo de classificação apresentou melhor desempenho na discriminação entre LA e BN (HC) quando o nível de variação relativa foi definido em 1,2 em vez de 1,5 ou 2,0 (Figura Suplementar 7a,b). O modelo de classificação, baseado em 27 grupos de metabólitos, foi posteriormente validado em coortes internas e externas. A AUC foi de 0,915 (sensibilidade de 0,867, especificidade de 0,811) para a validação interna e de 0,945 (sensibilidade de 0,810, especificidade de 0,979) para a validação externa (Fig. 2e, f). Para avaliar a eficiência interlaboratorial, 40 amostras da coorte externa foram analisadas em um laboratório externo, conforme descrito na seção Métodos. A acurácia da classificação atingiu uma AUC de 0,925 (Figura Suplementar 8). Como o carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) é o segundo subtipo mais comum de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), depois do adenocarcinoma de pulmão (LUAD), também testamos a utilidade potencial validada dos perfis metabólicos. BN e 16 casos de LUSC. A AUC de discriminação entre LUSC e BN foi de 0,776 (Figura Suplementar 9), indicando uma capacidade inferior em comparação com a discriminação entre LUAD e BN.
Estudos demonstraram que o tamanho dos nódulos em imagens de TC está positivamente correlacionado com a probabilidade de malignidade e permanece um importante determinante do tratamento de nódulos25,26,27. A análise de dados da grande coorte do estudo de rastreio NELSON mostrou que o risco de malignidade em indivíduos com nódulos <5 mm foi semelhante ao de indivíduos sem nódulos28. Portanto, o tamanho mínimo que requer monitoramento regular por TC é de 5 mm, conforme recomendado pela Sociedade Torácica Britânica (BTS), e de 6 mm, conforme recomendado pela Sociedade Fleischner29. No entanto, nódulos maiores que 6 mm e sem características benignas óbvias, denominados nódulos pulmonares indeterminados (NPI), continuam sendo um grande desafio na avaliação e no manejo na prática clínica30,31. Em seguida, examinamos se o tamanho do nódulo influenciava as assinaturas metabolômicas usando amostras agrupadas das coortes de descoberta e validação interna. Com foco em 27 biomarcadores validados, comparamos inicialmente os perfis de PCA dos metabolomas de nódulos sub-6 mm em indivíduos saudáveis (HC) e não saudáveis (BN). Constatamos que a maioria dos pontos de dados para HC e BN se sobrepunha, demonstrando que os níveis de metabólitos séricos eram semelhantes em ambos os grupos (Fig. 3a). Os mapas de características em diferentes faixas de tamanho permaneceram conservados em BN e LA (Fig. 3b, c), enquanto uma separação foi observada entre nódulos malignos e benignos na faixa de 6 a 20 mm (Fig. 3d). Essa coorte apresentou AUC de 0,927, especificidade de 0,868 e sensibilidade de 0,820 para prever a malignidade de nódulos medindo de 6 a 20 mm (Fig. 3e, f). Nossos resultados mostram que o classificador pode capturar alterações metabólicas causadas pela transformação maligna precoce, independentemente do tamanho do nódulo.
a) Comparação dos perfis de PCA entre grupos específicos com base em um classificador metabólico de 27 metabólitos. CC e BN < 6 mm. b) BN < 6 mm vs. BN 6–20 mm. em LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm. g) BN 6–20 mm e LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e) Curva ROC (Receiver Operating Characteristic) mostrando o desempenho do modelo discriminante para nódulos de 6–20 mm. f) Os valores de probabilidade foram calculados com base no modelo de regressão logística para nódulos medindo de 6–20 mm. A linha pontilhada cinza representa o valor de corte ideal (0,455). Os números acima representam a porcentagem de casos projetados para Los Angeles. Utilize o teste t de Student bicaudal. PCA, análise de componentes principais. AUC, área sob a curva. Os dados de origem são fornecidos na forma de arquivos de dados de origem.
Quatro amostras (com idades entre 44 e 61 anos) com tamanhos de nódulos pulmonares semelhantes (7 a 9 mm) foram selecionadas para ilustrar o desempenho do modelo de predição de malignidade proposto (Fig. 4a, b). Na triagem inicial, o Caso 1 apresentou-se como um nódulo sólido com calcificação, uma característica associada à benignidade, enquanto o Caso 2 apresentou-se como um nódulo indeterminado parcialmente sólido, sem características benignas óbvias. Três rodadas de tomografias computadorizadas de acompanhamento mostraram que esses casos permaneceram estáveis ao longo de um período de 4 anos e, portanto, foram considerados nódulos benignos (Fig. 4a). Comparada à avaliação clínica de tomografias computadorizadas seriadas, a análise de metabólitos séricos em dose única com o modelo de classificação atual identificou de forma rápida e correta esses nódulos benignos com base em restrições probabilísticas (Tabela 1). A Figura 4b, no Caso 3, mostra um nódulo com sinais de retração pleural, que é mais frequentemente associada à malignidade32. O Caso 4 apresentou-se como um nódulo indeterminado parcialmente sólido, sem evidência de causa benigna. Todos esses casos foram previstos como malignos de acordo com o modelo de classificação (Tabela 1). A avaliação do adenocarcinoma de pulmão foi demonstrada pelo exame histopatológico após a cirurgia de ressecção pulmonar (Fig. 4b). Para o conjunto de validação externa, o classificador metabólico previu com precisão dois casos de nódulos pulmonares indeterminados maiores que 6 mm (Figura Suplementar 10).
Imagens de TC em janela axial dos pulmões de dois casos de nódulos benignos. No caso 1, a TC após 4 anos mostrou um nódulo sólido estável medindo 7 mm com calcificação no lobo inferior direito. No caso 2, a TC após 5 anos revelou um nódulo estável, parcialmente sólido, com 7 mm de diâmetro no lobo superior direito. b Imagens de TC em janela axial dos pulmões e respectivos estudos anatomopatológicos de dois casos de adenocarcinoma em estágio I antes da ressecção pulmonar. O caso 3 revelou um nódulo com 8 mm de diâmetro no lobo superior direito com retração pleural. O caso 4 revelou um nódulo parcialmente sólido em vidro fosco medindo 9 mm no lobo superior esquerdo. Coloração com hematoxilina e eosina (H&E) do tecido pulmonar ressecado (barra de escala = 50 μm) demonstrando o padrão de crescimento acinar do adenocarcinoma de pulmão. As setas indicam os nódulos detectados nas imagens de TC. As imagens H&E são imagens representativas de múltiplos (>3) campos microscópicos examinados pelo patologista.
Em conjunto, nossos resultados demonstram o valor potencial dos biomarcadores de metabólitos séricos no diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares, que podem representar desafios na avaliação da triagem por tomografia computadorizada.
Com base em um painel de metabólitos diferenciais validado, buscamos identificar correlatos biológicos das principais alterações metabólicas. A análise de enriquecimento de vias KEGG pelo MetaboAnalyst identificou 6 vias comuns significativamente alteradas entre os dois grupos (LA vs. HC e LA vs. BN, p ajustado ≤ 0,001, efeito > 0,01). Essas alterações foram caracterizadas por distúrbios no metabolismo do piruvato, metabolismo do triptofano, metabolismo da niacina e nicotinamida, glicólise, ciclo do TCA e metabolismo das purinas (Fig. 5a). Em seguida, realizamos metabolômica direcionada para verificar as principais alterações usando quantificação absoluta. Determinação de metabólitos comuns em vias comumente alteradas por espectrometria de massa de triplo quadrupolo (QQQ) usando padrões autênticos de metabólitos. As características demográficas da amostra alvo do estudo metabolômico estão incluídas na Tabela Suplementar 4. De acordo com nossos resultados metabolômicos globais, a análise quantitativa confirmou que a hipoxantina e a xantina, o piruvato e o lactato estavam aumentados no grupo LA em comparação com os grupos BN e HC (Fig. 5b, c, p < 0,05). No entanto, não foram encontradas diferenças significativas nesses metabólitos entre os grupos BN e HC.
Análise de enriquecimento de vias KEGG de metabólitos significativamente diferentes no grupo LA em comparação com os grupos BN e HC. Foi utilizado um teste Globaltest bicaudal e os valores de p foram ajustados pelo método de Holm-Bonferroni (p ajustado ≤ 0,001 e tamanho do efeito > 0,01). b–d Gráficos de violino mostrando os níveis de hipoxantina, xantina, lactato, piruvato e triptofano no soro de HC, BN e LA determinados por LC-MS/MS (n = 70 por grupo). As linhas pontilhadas brancas e pretas indicam a mediana e o quartil, respectivamente. e Gráfico de violino mostrando a expressão normalizada de mRNA Log2TPM (transcritos por milhão) de SLC7A5 e QPRT em adenocarcinoma de pulmão (n = 513) em comparação com tecido pulmonar normal (n = 59) no conjunto de dados LUAD-TCGA. A caixa branca representa o intervalo interquartil, a linha preta horizontal no centro representa a mediana e a linha preta vertical que se estende a partir da caixa representa o intervalo de confiança (IC) de 95%. f Gráfico de correlação de Pearson da expressão de SLC7A5 e GAPDH em adenocarcinoma de pulmão (n = 513) e tecido pulmonar normal (n = 59) no conjunto de dados TCGA. A área cinza representa o IC de 95%. r, coeficiente de correlação de Pearson. g Níveis celulares normalizados de triptofano em células A549 transfectadas com shRNA controle não específico (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinados por LC-MS/MS. A análise estatística de cinco amostras biologicamente independentes em cada grupo é apresentada. h Níveis celulares de NADt (NAD total, incluindo NAD+ e NADH) em células A549 (NC) e células A549 com silenciamento de SLC7A5 (Sh1, Sh2). A análise estatística de três amostras biologicamente independentes em cada grupo é apresentada. i A atividade glicolítica das células A549 antes e depois do silenciamento de SLC7A5 foi medida pela taxa de acidificação extracelular (ECAR) (n = 4 amostras biologicamente independentes por grupo). 2-DG,2-desoxi-D-glicose. O teste t de Student bicaudal foi usado em (b–h). Em (g–i), as barras de erro representam a média ± DP; cada experimento foi realizado três vezes de forma independente e os resultados foram semelhantes. Os dados originais são fornecidos na forma de arquivos de dados originais.
Considerando o impacto significativo do metabolismo alterado do triptofano no grupo LA, também avaliamos os níveis séricos de triptofano nos grupos HC, BN e LA utilizando o método QQQ. Observamos que o triptofano sérico estava reduzido no grupo LA em comparação com os grupos HC ou BN (p < 0,001, Figura 5d), o que está de acordo com achados anteriores que demonstram níveis circulantes de triptofano mais baixos em pacientes com câncer de pulmão do que em controles saudáveis do grupo controle33,34,35. Outro estudo utilizando o traçador PET/CT 11C-metil-L-triptofano demonstrou que o tempo de retenção do sinal de triptofano no tecido pulmonar canceroso estava significativamente aumentado em comparação com lesões benignas ou tecido normal36. Nossa hipótese é que a diminuição do triptofano no soro do grupo LA possa refletir a captação ativa de triptofano pelas células do câncer de pulmão.
Sabe-se também que o produto final da via da quinurenina no catabolismo do triptofano é o NAD+37,38, um substrato importante para a reação do gliceraldeído-3-fosfato com o 1,3-bisfosfoglicerato na glicólise39. Enquanto estudos anteriores se concentraram no papel do catabolismo do triptofano na regulação imunológica, buscamos elucidar a interação entre a desregulação do triptofano e as vias glicolíticas observadas no presente estudo. O transportador de soluto da família 7, membro 5 (SLC7A5), é conhecido por ser um transportador de triptofano43,44,45. A fosforribosiltransferase do ácido quinolínico (QPRT) é uma enzima localizada a jusante da via da quinurenina que converte o ácido quinolínico em NAMN46. A análise do conjunto de dados LUAD TCGA revelou que tanto o SLC7A5 quanto o QPRT estavam significativamente superexpressos no tecido tumoral em comparação com o tecido normal (Fig. 5e). Esse aumento foi observado nos estágios I e II, bem como nos estágios III e IV do adenocarcinoma de pulmão (Figura Suplementar 11), indicando distúrbios precoces no metabolismo do triptofano associados à tumorigênese.
Adicionalmente, o conjunto de dados LUAD-TCGA mostrou uma correlação positiva entre a expressão de mRNA de SLC7A5 e GAPDH em amostras de pacientes com câncer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f). Em contraste, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre essas assinaturas genéticas em tecido pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f). O silenciamento de SLC7A5 (Figura Suplementar 12) em células A549 reduziu significativamente os níveis celulares de triptofano e NAD(H) (Figura 5g,h), resultando em atividade glicolítica atenuada, medida pela taxa de acidificação extracelular (ECAR) (Figura 1). 5i). Assim, com base nas alterações metabólicas no soro e na detecção in vitro, hipotetizamos que o metabolismo do triptofano pode produzir NAD+ através da via da quinurenina e desempenhar um papel importante na promoção da glicólise no câncer de pulmão.
Estudos demonstraram que um grande número de nódulos pulmonares indeterminados detectados por TC de baixa dose pode levar à necessidade de exames adicionais, como PET-CT, biópsia pulmonar e sobretratamento devido a um diagnóstico falso-positivo de malignidade.31 Como mostrado na Figura 6, nosso estudo identificou um painel de metabólitos séricos com potencial valor diagnóstico que pode melhorar a estratificação de risco e o manejo subsequente de nódulos pulmonares detectados por TC.
Os nódulos pulmonares são avaliados por meio de tomografia computadorizada de baixa dose (TCBD), com características de imagem sugestivas de causas benignas ou malignas. O prognóstico incerto dos nódulos pode levar a consultas de acompanhamento frequentes, intervenções desnecessárias e sobretratamento. A inclusão de classificadores metabólicos séricos com valor diagnóstico pode melhorar a avaliação de risco e o manejo subsequente dos nódulos pulmonares. PET: tomografia por emissão de pósitrons.
Dados do estudo NLST dos EUA e do estudo europeu NELSON sugerem que o rastreio de grupos de alto risco com tomografia computadorizada de baixa dose (TCBD) pode reduzir a mortalidade por câncer de pulmão1,3. No entanto, a avaliação de risco e o subsequente manejo clínico de um grande número de nódulos pulmonares incidentais detectados por TCBD continuam sendo os maiores desafios. O principal objetivo é otimizar a classificação correta dos protocolos existentes baseados em TCBD, incorporando biomarcadores confiáveis.
Certos biomarcadores moleculares, como metabólitos sanguíneos, foram identificados comparando-se o câncer de pulmão com controles saudáveis15,17. No presente estudo, focamos na aplicação da análise metabolômica sérica para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos detectados incidentalmente por TC de baixa dose (TCBD). Comparamos o metaboloma sérico global de amostras de controles saudáveis (CS), nódulos pulmonares benignos (NP) e adenocarcinoma de pulmão em estágio I (AL) utilizando análise por UPLC-HRMS. Observamos que CS e NP apresentaram perfis metabólicos semelhantes, enquanto AL mostrou alterações significativas em comparação com CS e NP. Identificamos dois conjuntos de metabólitos séricos que diferenciam AL de CS e NP.
O esquema atual de identificação de nódulos benignos e malignos baseado em TC de baixa dose (TCBD) baseia-se principalmente no tamanho, densidade, morfologia e taxa de crescimento dos nódulos ao longo do tempo30. Estudos anteriores demonstraram que o tamanho dos nódulos está intimamente relacionado à probabilidade de câncer de pulmão. Mesmo em pacientes de alto risco, o risco de malignidade em nódulos <6 mm é <1%. O risco de malignidade para nódulos que medem de 6 a 20 mm varia de 8% a 64%30. Portanto, a Sociedade Fleischner recomenda um diâmetro de corte de 6 mm para acompanhamento de rotina por TC.29 No entanto, a avaliação de risco e o manejo de nódulos pulmonares indeterminados (NPI) maiores que 6 mm não têm sido adequadamente realizados31. O manejo atual de cardiopatias congênitas geralmente se baseia na observação vigilante com monitoramento frequente por TC.
Com base no metaboloma validado, demonstramos pela primeira vez a sobreposição de assinaturas metabolômicas entre indivíduos saudáveis e nódulos benignos <6 mm. A similaridade biológica é consistente com achados anteriores em tomografia computadorizada (TC), que mostram que o risco de malignidade para nódulos <6 mm é tão baixo quanto para indivíduos sem nódulos.30 Deve-se notar que nossos resultados também demonstram que nódulos benignos <6 mm e ≥6 mm apresentam alta similaridade nos perfis metabolômicos, sugerindo que a definição funcional de etiologia benigna é consistente independentemente do tamanho do nódulo. Assim, painéis modernos de metabólitos séricos para diagnóstico podem fornecer um único ensaio como teste de exclusão quando nódulos são detectados inicialmente em TC, reduzindo potencialmente o monitoramento seriado. Ao mesmo tempo, o mesmo painel de biomarcadores metabólicos diferenciou nódulos malignos ≥6 mm de nódulos benignos e forneceu previsões precisas para nódulos pulmonares invasivos (NPIs) de tamanho semelhante e características morfológicas ambíguas em imagens de TC. Este classificador de metabolismo sérico apresentou bom desempenho na predição da malignidade de nódulos ≥6 mm, com uma AUC de 0,927. Em conjunto, nossos resultados indicam que assinaturas metabolômicas séricas únicas podem refletir especificamente alterações metabólicas precoces induzidas pelo tumor e ter valor potencial como preditores de risco, independentemente do tamanho do nódulo.
Notavelmente, o adenocarcinoma de pulmão (LUAD) e o carcinoma de células escamosas de pulmão (LUSC) são os principais tipos de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC). Dado que o LUSC está fortemente associado ao tabagismo47 e o LUAD é a histologia mais comum de nódulos pulmonares incidentais detectados em exames de tomografia computadorizada (TC)48, nosso modelo de classificação foi especificamente desenvolvido para amostras de adenocarcinoma em estágio I. Wang e colaboradores também se concentraram no LUAD e identificaram nove assinaturas lipídicas usando lipidômica para distinguir o câncer de pulmão em estágio inicial de indivíduos saudáveis17. Testamos o modelo de classificação atual em 16 casos de LUSC em estágio I e 74 nódulos benignos e observamos baixa acurácia de predição para LUSC (AUC 0,776), sugerindo que o LUAD e o LUSC podem ter suas próprias assinaturas metabolômicas. De fato, já foi demonstrado que o LUAD e o LUSC diferem em etiologia, origem biológica e aberrações genéticas49. Portanto, outros tipos de histologia devem ser incluídos nos modelos de treinamento para detecção populacional de câncer de pulmão em programas de rastreamento.
Neste estudo, identificamos as seis vias metabólicas mais frequentemente alteradas no adenocarcinoma de pulmão em comparação com controles saudáveis e nódulos benignos. Xantina e hipoxantina são metabólitos comuns da via metabólica das purinas. De acordo com nossos resultados, intermediários associados ao metabolismo das purinas estavam significativamente aumentados no soro ou nos tecidos de pacientes com adenocarcinoma de pulmão em comparação com controles saudáveis ou pacientes no estágio pré-invasivo15,50. Níveis elevados de xantina e hipoxantina no soro podem refletir o anabolismo necessário para a rápida proliferação de células cancerígenas. A desregulação do metabolismo da glicose é uma característica bem conhecida do metabolismo do câncer51. Aqui, observamos um aumento significativo de piruvato e lactato no grupo LA em comparação com os grupos HC e BN, o que está de acordo com relatos anteriores de anormalidades na via glicolítica nos perfis do metaboloma sérico de pacientes com câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) e controles saudáveis. Os resultados são consistentes52,53.
É importante destacar que observamos uma correlação inversa entre o metabolismo do piruvato e do triptofano no soro de pacientes com adenocarcinoma de pulmão. Os níveis séricos de triptofano estavam reduzidos no grupo LA em comparação com os grupos HC ou BN. Curiosamente, um estudo anterior de grande escala, utilizando uma coorte prospectiva, constatou que baixos níveis de triptofano circulante estavam associados a um risco aumentado de câncer de pulmão54. O triptofano é um aminoácido essencial que obtemos exclusivamente da alimentação. Concluímos que a depleção de triptofano sérico no adenocarcinoma de pulmão pode refletir uma rápida depleção desse metabólito. É sabido que o produto final do catabolismo do triptofano pela via da quinurenina é a fonte da síntese de novo de NAD+. Como o NAD+ é produzido principalmente pela via de recuperação, a importância do NAD+ no metabolismo do triptofano na saúde e na doença ainda precisa ser determinada46. Nossa análise do banco de dados TCGA mostrou que a expressão do transportador de triptofano SLC7A5 (transportador de soluto 7A5) estava significativamente aumentada no adenocarcinoma de pulmão em comparação com controles normais e correlacionada positivamente com a expressão da enzima glicolítica GAPDH. Estudos anteriores focaram principalmente no papel do catabolismo do triptofano na supressão da resposta imune antitumoral40,41,42. Aqui, demonstramos que a inibição da captação de triptofano por meio do silenciamento do SLC7A5 em células de câncer de pulmão resulta em uma subsequente diminuição dos níveis celulares de NAD e uma atenuação concomitante da atividade glicolítica. Em resumo, nosso estudo fornece uma base biológica para as alterações no metabolismo sérico associadas à transformação maligna do adenocarcinoma de pulmão.
Mutações no EGFR são as mutações condutoras mais comuns em pacientes com câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC). Em nosso estudo, observamos que pacientes com mutação no EGFR (n = 41) apresentaram perfis metabolômicos gerais semelhantes aos de pacientes com EGFR selvagem (n = 31), embora tenhamos encontrado níveis séricos reduzidos de acilcarnitina em alguns pacientes com mutação no EGFR. A função estabelecida das acilcarnitinas é transportar grupos acil do citoplasma para a matriz mitocondrial, levando à oxidação de ácidos graxos para a produção de energia55. Em consonância com nossos achados, um estudo recente também identificou perfis metabolômicos semelhantes entre tumores com mutação no EGFR e tumores com EGFR selvagem, por meio da análise do metaboloma global de 102 amostras de tecido de adenocarcinoma de pulmão50. Curiosamente, o conteúdo de acilcarnitina também foi encontrado no grupo com mutação no EGFR. Portanto, se as alterações nos níveis de acilcarnitina refletem alterações metabólicas induzidas pelo EGFR e quais as vias moleculares subjacentes, isso pode merecer estudos adicionais.
Em conclusão, nosso estudo estabelece um classificador metabólico sérico para o diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares e propõe um fluxo de trabalho que pode otimizar a avaliação de risco e facilitar o manejo clínico com base na triagem por tomografia computadorizada.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Oncológico da Universidade Sun Yat-sen, pelo Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen e pelo Comitê de Ética do Hospital Oncológico da Universidade de Zhengzhou. Nos grupos de descoberta e validação interna, foram coletadas 174 amostras de soro de indivíduos saudáveis e 244 amostras de soro de nódulos benignos de indivíduos submetidos a exames médicos anuais no Departamento de Controle e Prevenção do Câncer do Centro Oncológico da Universidade Sun Yat-sen, além de 166 amostras de soro de nódulos benignos. Amostras de adenocarcinoma de pulmão em estágio I foram coletadas do Centro Oncológico da Universidade Sun Yat-sen. Na coorte de validação externa, foram incluídos 48 casos de nódulos benignos, 39 casos de adenocarcinoma de pulmão em estágio I do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen e 24 casos de adenocarcinoma de pulmão em estágio I do Hospital Oncológico de Zhengzhou. O Centro Oncológico da Universidade Sun Yat-sen também coletou 16 casos de carcinoma de células escamosas de pulmão em estágio I para testar a capacidade diagnóstica do classificador metabólico estabelecido (as características dos pacientes são apresentadas na Tabela Suplementar 5). Amostras da coorte de descoberta e da coorte de validação interna foram coletadas entre janeiro de 2018 e maio de 2020. Amostras para a coorte de validação externa foram coletadas entre agosto de 2021 e outubro de 2022. Para minimizar o viés de gênero, números aproximadamente iguais de casos masculinos e femininos foram alocados a cada coorte. Equipe de Descoberta e Equipe de Revisão Interna. O gênero dos participantes foi determinado com base em autodeclaração. O consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os participantes e nenhuma compensação foi oferecida. Os indivíduos com nódulos benignos foram aqueles com escore estável na tomografia computadorizada (TC) de 2 a 5 anos no momento da análise, com exceção de um caso da amostra de validação externa, coletado no pré-operatório e diagnosticado por histopatologia. Com exceção da bronquite crônica, os casos de adenocarcinoma de pulmão foram coletados antes da ressecção pulmonar e confirmados por diagnóstico patológico. Amostras de sangue em jejum foram coletadas em tubos de separação de soro sem anticoagulantes. As amostras de sangue foram coaguladas por 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugadas a 2851 × g por 10 minutos a 4 °C para coleta do sobrenadante de soro. Alíquotas de soro foram congeladas a -80°C até a extração dos metabólitos. O Departamento de Prevenção do Câncer e Exames Médicos do Centro de Câncer da Universidade Sun Yat-sen coletou um pool de soro de 100 doadores saudáveis, incluindo um número igual de homens e mulheres com idades entre 40 e 55 anos. Volumes iguais de cada amostra de doador foram misturados, o pool resultante foi aliquotado e armazenado a -80°C. A mistura de soro foi utilizada como material de referência para controle de qualidade e padronização dos dados.
O soro de referência e as amostras de teste foram descongelados e os metabólitos foram extraídos utilizando um método de extração combinado (MTBE/metanol/água)56. Resumidamente, 50 μl de soro foram misturados com 225 μl de metanol gelado e 750 μl de éter metil-terc-butílico (MTBE) gelado. A mistura foi agitada e incubada em gelo por 1 hora. As amostras foram então misturadas e homogeneizadas em vórtex com 188 μl de água para espectrometria de massas contendo padrões internos (lactato-13C, piruvato-13C, metionina-13C e isoleucina-13C, adquiridos da Cambridge Isotope Laboratories). A mistura foi então centrifugada a 15.000 × g por 10 min a 4 °C, e a fase inferior foi transferida para dois tubos (125 μL cada) para análise por LC-MS nos modos positivo e negativo. Por fim, a amostra foi evaporada até a secura em um concentrador a vácuo de alta velocidade.
Os metabólitos secos foram reconstituídos em 120 μl de acetonitrila a 80%, homogeneizados em vórtex por 5 min e centrifugados a 15.000 × g por 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram transferidos para frascos de vidro âmbar com microinserções para estudos metabolômicos. A análise metabolômica não direcionada foi realizada em uma plataforma de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (UPLC-HRMS). Os metabólitos foram separados utilizando um sistema UPLC Dionex Ultimate 3000 e uma coluna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). No modo de íons positivos, as fases móveis foram 95% (A) e 50% de acetonitrila (B), cada uma contendo 10 mmol/L de acetato de amônio e 0,1% de ácido fórmico. No modo negativo, as fases móveis A e B continham 95% e 50% de acetonitrila, respectivamente, ambas contendo 10 mmol/L de acetato de amônio, pH = 9. O programa de gradiente foi o seguinte: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. A coluna foi mantida a 40 °C e a amostra a 10 °C no amostrador automático. A vazão foi de 0,3 mL/min e o volume de injeção foi de 3 μL. Um espectrômetro de massas Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) com fonte de ionização por eletrospray (ESI) foi operado no modo de varredura completa e acoplado ao modo de monitoramento ddMS2 para coletar grandes volumes de dados. Os parâmetros de MS foram definidos da seguinte forma: tensão de pulverização +3,8 kV/-3,2 kV, temperatura do capilar 320 °C, gás de proteção 40 arb, gás auxiliar 10 arb, temperatura do aquecedor da sonda 350 °C, faixa de varredura 70–1050 m/h, resolução 70.000. Os dados foram adquiridos usando o software Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Para avaliar a qualidade dos dados, amostras de controle de qualidade (CQ) agrupadas foram geradas pela remoção de alíquotas de 10 μL do sobrenadante de cada amostra. Seis injeções de amostras de controle de qualidade foram analisadas no início da sequência analítica para avaliar a estabilidade do sistema UPLC-MS. As amostras de controle de qualidade são então introduzidas periodicamente no lote. Todos os 11 lotes de amostras de soro deste estudo foram analisados por LC-MS. Alíquotas de uma mistura de soro agrupado de 100 doadores saudáveis foram utilizadas como material de referência nos respectivos lotes para monitorar o processo de extração e ajustar os efeitos entre lotes. A análise metabolômica não direcionada da coorte de descoberta, da coorte de validação interna e da coorte de validação externa foi realizada no Centro de Metabolômica da Universidade Sun Yat-sen. O laboratório externo do Centro de Análise e Testes da Universidade de Tecnologia de Guangdong também analisou 40 amostras da coorte externa para testar o desempenho do modelo de classificação.
Após extração e reconstituição, a quantificação absoluta dos metabólitos séricos foi realizada por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (UHPLC-MS/MS) (Agilent 6495 triplo quadrupolo) com fonte de ionização por electrospray (ESI) no modo de monitoramento de múltiplas reações (MRM). Uma coluna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) foi utilizada para a separação dos metabólitos. A fase móvel consistiu em 90% (A) e 5% de acetonitrila (B) com 10 mmol/L de acetato de amônio e 0,1% de solução de amônia. O programa de gradiente foi o seguinte: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0%B. A coluna foi mantida a 40 °C e a amostra a 10 °C no amostrador automático. A vazão foi de 0,3 mL/min e o volume de injeção foi de 1 μL. Os parâmetros de MS foram definidos da seguinte forma: tensão capilar ±3,5 kV, pressão do nebulizador 35 psi, fluxo de gás de proteção 12 L/min, temperatura do gás de proteção 350 °C, temperatura do gás de secagem 250 °C e fluxo de gás de secagem 14 L/min. As conversões MRM de triptofano, piruvato, lactato, hipoxantina e xantina foram 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 e 151,0–107,9, respectivamente. Os dados foram coletados utilizando o Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Para as amostras de soro, o triptofano, o piruvato, o lactato, a hipoxantina e a xantina foram quantificados utilizando curvas de calibração de soluções padrão. Para as amostras celulares, o teor de triptofano foi normalizado em relação ao padrão interno e à massa proteica celular.
A extração dos picos (m/z e tempo de retenção (TR)) foi realizada utilizando o Compound Discovery 3.1 e o TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Para eliminar potenciais diferenças entre lotes, cada pico característico da amostra de teste foi dividido pelo pico característico do material de referência do mesmo lote para obter a abundância relativa. Os desvios padrão relativos dos padrões internos antes e depois da padronização são mostrados na Tabela Suplementar 6. As diferenças entre os dois grupos foram caracterizadas pela taxa de falsos positivos (FDR < 0,05, teste de Wilcoxon para postos sinalizados) e pela variação relativa (> 1,2 ou < 0,83). Os dados brutos de espectrometria de massas (MS) das características extraídas e os dados de MS corrigidos para o soro de referência são mostrados nos Dados Suplementares 1 e 2, respectivamente. A anotação dos picos foi realizada com base em quatro níveis de identificação definidos, incluindo metabólitos identificados, compostos putativamente anotados, classes de compostos putativamente caracterizadas e compostos desconhecidos. Com base em buscas em bancos de dados no Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), compostos biológicos com correspondência MS/MS a padrões validados ou anotações de correspondência exata no mzCloud (pontuação > 85) ou no Chemspider foram finalmente selecionados como intermediários entre os metabolomas diferenciais. As anotações de pico para cada característica estão incluídas nos Dados Suplementares 3. O MetaboAnalyst 5.0 foi utilizado para a análise univariada da abundância de metabólitos normalizada pela soma. O MetaboAnalyst 5.0 também avaliou a análise de enriquecimento de vias KEGG com base em metabólitos significativamente diferentes. A análise de componentes principais (PCA) e a análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foram analisadas utilizando o pacote de software ropls (v.1.26.4) com normalização de pilha e autoescalonamento. O modelo de biomarcador metabólico ideal para prever a malignidade do nódulo foi gerado utilizando regressão logística binária com operador de seleção e redução de mínimos quadrados absolutos (LASSO, pacote R v.4.1-3). O desempenho do modelo discriminante nos conjuntos de detecção e validação foi caracterizado pela estimativa da AUC com base na análise ROC, utilizando o pacote pROC (v.1.18.0). O ponto de corte de probabilidade ideal foi obtido com base no índice de Youden máximo do modelo (sensibilidade + especificidade – 1). Amostras com valores menores ou maiores que o limiar serão classificadas como nódulos benignos e adenocarcinoma de pulmão, respectivamente.
Células A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) foram cultivadas em meio F-12K contendo 10% de FBS. Sequências de RNA de interferência curta (shRNA) direcionadas ao gene SLC7A5 e um controle não direcionado (NC) foram inseridas no vetor lentiviral pLKO.1-puro. As sequências antisense de shSLC7A5 são as seguintes: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Anticorpos contra SLC7A5 (#5347) e tubulina (#2148) foram adquiridos da Cell Signaling Technology. Os anticorpos contra SLC7A5 e tubulina foram utilizados na diluição de 1:1000 para análise por Western blot.
O teste de estresse glicolítico Seahorse XF mede os níveis de acidificação extracelular (ECAR). No ensaio, glicose, oligomicina A e 2-DG foram administrados sequencialmente para testar a capacidade glicolítica celular, medida pela ECAR.
Células A549 transfectadas com o controle não direcionado (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) foram plaqueadas durante a noite em placas de 10 cm de diâmetro. Os metabólitos celulares foram extraídos com 1 ml de metanol aquoso a 80% gelado. As células na solução de metanol foram raspadas, coletadas em um novo tubo e centrifugadas a 15.000 × g por 15 min a 4 °C. Coletou-se 800 µl do sobrenadante e secou-se usando um concentrador a vácuo de alta velocidade. Os pellets de metabólitos secos foram então analisados quanto aos níveis de triptofano usando LC-MS/MS, conforme descrito acima. Os níveis celulares de NAD(H) em células A549 (NC e shSLC7A5) foram medidos usando um kit colorimétrico quantitativo de NAD+/NADH (#K337, BioVision) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de proteína foram medidos para cada amostra para normalizar a quantidade de metabólitos.
Não foram utilizados métodos estatísticos para determinar preliminarmente o tamanho da amostra. Estudos metabolômicos anteriores, com o objetivo de descobrir biomarcadores15,18, foram considerados como referências para a determinação do tamanho da amostra e, em comparação com esses relatos, nossa amostra foi adequada. Nenhuma amostra foi excluída da coorte do estudo. As amostras de soro foram aleatoriamente alocadas a um grupo de descoberta (306 casos, 74,6%) e a um grupo de validação interna (104 casos, 25,4%) para estudos metabolômicos não direcionados. Também selecionamos aleatoriamente 70 casos de cada grupo do conjunto de descoberta para estudos metabolômicos direcionados. Os investigadores desconheciam a alocação dos grupos durante a coleta e análise dos dados de LC-MS. As análises estatísticas dos dados metabolômicos e dos experimentos celulares são descritas nas respectivas seções de Resultados, Legendas das Figuras e Métodos. A quantificação do triptofano celular, do NADT e da atividade glicolítica foi realizada três vezes de forma independente, com resultados idênticos.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o Resumo do Relatório de Portfólio Natural associado a este artigo.
Os dados brutos de espectrometria de massa (MS) das características extraídas e os dados de MS normalizados do soro de referência são apresentados nos Dados Suplementares 1 e 2, respectivamente. As anotações dos picos para as características diferenciais são apresentadas nos Dados Suplementares 3. O conjunto de dados LUAD TCGA pode ser baixado em https://portal.gdc.cancer.gov/. Os dados de entrada para a construção do gráfico estão disponíveis nos dados de origem. Os dados de origem são fornecidos para este artigo.
Grupo de estudo de rastreio pulmonar nacional, etc. Reduzindo a mortalidade por câncer de pulmão com tomografia computadorizada de baixa dose. Norte da Inglaterra. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR e Prophet, PC. Rastreamento de câncer de pulmão usando TC helicoidal de baixa dose: resultados do Estudo Nacional de Rastreamento de Pulmão (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Reduzindo a mortalidade por câncer de pulmão com rastreamento volumétrico por TC em um ensaio randomizado. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Data da publicação: 18/09/2023